一、目的要求
1．学习酶的纯化方法，了解酶蛋白分离提纯的原理。
2．学习掌握细胞破壁、有机溶剂分级和离子交换柱层析技术。
3．学习独立设计实验应遵循的原则。
二、实验原理
蔗糖酶主要存在于酵母中，故工业上通常从酵母中制取。酵母蔗糖酶系胞内酶，提取时细胞破碎或菌体自溶。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、离子交换和凝胶柱层析，以此可得到较高纯度的酶。
细胞破壁的几种方法如下：
（1）高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约 1/3 体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
（2）玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎。此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
（3）反复冻融法：将细胞在-20℃以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
（4）超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂。此法多适用于微生物材料。
（5）化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，采用溶菌酶处理效果更好。
有机溶剂沉淀法即向水溶液中加入一定量的亲水性的有机溶剂，可降低溶质的溶解度使其沉淀被析出。
三、仪器与试剂
制冷机如图3-2-1所示。
（1）实验材料：啤酒酵母（市售安琪酵母）。
（2）实验试剂：二氧化硅、甲苯（使用前预冷到 0℃以下）、去离子水（使用前冷至 4℃左右）、1 mol/L 醋酸、95%乙醇等。
（3）实验器材与仪器：研钵1个、离心管3个、滴管3个、量筒50 m L 1个、水浴锅1个、恒温水浴1个、烧杯100 m L 2个、p H试纸、高速冷冻离心机。
图3-2-1 制冷机
四、实验操作与步骤
1．蔗糖酶的提取
（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。预先在冰箱中冷却5 g干酵母和2.5 g二氧化硅。
（2）将5 g干酵母和2.5 g二氧化硅，放入研钵中。量取预冷的甲苯15 m L缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需60 min。研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。
（3）缓慢加入预冷的20 m L去离子水，每次加2 m L左右，边加边研磨，至少用30 min，以便将蔗糖酶充分转入水相。
（4）将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷离心机离心，4℃，10 000 r/min，10 min。如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相。
（5）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，10 000 r/min，离心10 min。
（6）将清液转入量筒，量出体积，留出1.5 m L测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁离心管中。
（7）用p H试纸检查清液p H值，用1 mol/L 醋酸将p H值调至5.0，称为“粗级分I”。
2．提取物的热处理
（1）预先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温30 min，在保温过程中不断轻摇离心管。
（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，4℃，10 000 r/min，离心15 min。
（3）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5 m L测定酶活力及蛋白质含量（称为热级分II）。
3．提取物的乙醇沉淀
将热级分II转入小烧杯中，放入冰盐浴（没有水的碎冰撒入少量食盐），逐滴加入等体积预冷至-20℃的95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需30 min，再在冰盐浴中放置10 min，以沉淀完全。于 4℃，10 000 r/min，离心 10 min，倾去上清，并滴干，离心管中沉淀用 5～8 m L Tris-HCl（p H7.3）缓冲液充分溶解（若溶液混浊，则用小试管，4 000 r/min离心除去不溶物），量出体积，留出1.5 m L测定酶活力及蛋白质含量（醇级分Ⅲ）。剩余部分交给老师，用于以后的实验。
4．蔗糖酶活性及蛋白质浓度的测定
（1）各级分蛋白质浓度测定。
① 蛋白质浓度测定——标准曲线的制备。取12支干净试管，分两组按表3-2-1编号并加入试剂混匀。以吸光度平均值为纵坐标、各管蛋白含量作为横坐标作图得标准曲线。
② 各级分蛋白浓度的测定。取7 支干净试管，每级分做两管，按表3-2-2 编号并加入试剂混匀。读取吸光度值。以各级分的吸光度的平均值查标准曲线即可求出蛋白质含量。各级分应进行一定倍数的稀释，先试做，选其吸光度值在标准曲线内为宜。
（2）各级分蔗糖酶活性的定性和半定量测定。在点滴板上每个孔中滴加一滴 0.2 mol/L p H4.6的醋酸缓冲液，再滴加一滴0.5 mol/L蔗糖溶液和各级分的稀释溶液，反应5 min，使用血糖仪进行自动测量。结果列于表3-2-3。
表3-2-1 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度——标准曲线的绘制
表3-2-2 各级分蛋白浓度的测定
表3-2-3 各级分蛋白酶活性的测定
定性：以-，±，＋，＋＋，＋＋＋，＋＋＋＋代表酶活力大小。
五、实验说明
（1）整个提取过程要在冷链条件下进行。
（2）酶活的测定要进行适度的稀释。
（3）不同级分的蛋白含量与酶活有不一样的结果，要加以注意。
六、思考题
1．简述血糖仪测定酶活的原理。
2．常用蛋白酶沉淀的方法有哪些？可否使用之？
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