核酸的分离与纯化

研究核酸的首要任务就是从细胞混合物中分离和纯化核酸，以及将基因组切割成可处理的片断，以便于特定的DNA序列的操作和分析。核酸分离纯化过程中特别需要注意的是防止核酸的降解和变性，要尽量保持其在生物体内的天然状态，因此必须采用温和的条件，避免过酸、过碱、剧烈搅拌等以防止核酸分子变性，还要注意抑制核酸酶的活性防止核酸被降解。核酸的提纯没有统一的方法，一般需根据实验目的和核酸的特性，选取合适的分离纯化程序。几种常用的纯化方法介绍如下。

1．酚提取法 真核生物中的染色体DNA与碱性蛋白质结合成核蛋白（DNP）形式存在于核中。DNP能溶于水和浓盐溶液（如1mol/L NaCl），但不溶于生理盐溶液（如0．14mol/L NaCl）。利用这一性质，可将细胞破碎后用浓盐溶液提取，再用水稀释至生理盐浓度，使DNP沉淀出来。苯酚是很强的蛋白质变性剂，用水饱和的苯酚与DNP样品一起震荡后，DNA溶于上层水相，不溶性的和变性蛋白质残留物位于中间界面及酚相，经冷冻离心，得到水相中的DNA，再用适当浓度的盐和乙醇使DNA沉淀析出，得到纯的DNA。为了得到大分子的DNA，避免核酸酶和机械震荡对DNA的降解，常在细胞溶液中加入2倍体积含1％十二烷基硫酸钠（SDS）的缓冲液，并加入广谱蛋白酶（如蛋白酶K），经保温后使细胞蛋白质降解，再用苯酚抽提。DNA样品中的RNA可用纯的RNA酶（RNase）分解除去。

酚提取法同样可用于RNA的提取，但由于RNA不如DNA稳定，而且RNase又无处不在，因此分离更为困难。通常需要将用于制备RNA的器皿都预先进行去RNase处理（如高温烘烤、高压灭菌、0．1％焦碳酸二乙酯处理等方法），在破碎细胞时加入强的变性剂使RNase失活，在整个反应体系中都要加入RNase抑制剂（如Rnasin）等。一般采用酸性胍盐/苯酚/氯仿来抽提RNA，异硫氰酸胍是极强的蛋白变性剂，几乎可使所有蛋白质都变性。然后用苯酚和氯仿多次处理，以除尽蛋白质。

2．超速离心法 溶液中的核酸在引力场中可以下沉而达到分离目的。在超速离心造成的极大离心力场中，不同分子量的核酸分子沉降速率不同；利用沉降和平衡原理，采用不同密度梯度的介质可将不同分子量的核酸分子分离。常用的有蔗糖梯度密度离心和氯化铯密度梯度离心。这种方法还可用于测定核酸的沉降常数和分子量，以及研究核酸的构象变化和动力学过程。

3．凝胶电泳法 由于核酸是两性分子，通常显电负性，不同核酸分子量大小不一、构象不同，故可采用电泳法分离核酸。常用的凝胶介质有琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶，可以在水平或垂直的电泳槽中进行。凝胶电泳兼有分子筛和电泳双重效果，所以分离效率好，还具有简单、快速、灵敏、成本低等优点。

4．层析分离法 利用被分离核酸与生物分子（配体）具有特殊亲和力，能可逆地结合与解离，可采用亲和层析分离法。配体是亲和层析的关键，其一端能与固相载体凝胶共价连接，另一端与被分离核酸能形成可逆的、专一的非共价结合，在适当条件下可被洗脱下来。常用的亲和层析介质有oligo－dT琼脂糖，用于分离含有poly（A）尾的mRNA。

核酸抽提完成以后，还需要对样品进行鉴定、保存与应用。常用的鉴定方法有紫外分光光度法、凝胶电泳法以及测序分析等。紫外分光光度法前已提及。凝胶电泳法是用溴化乙锭等荧光染料作为示踪剂，根据核酸电泳结果判定核酸的浓度、纯度及完整性。还可以将凝胶电泳条带进行切割回收，作进一步的测序分析。将DNA样品溶于TE缓冲液在－70℃可以储存数年，RNA可溶于0．3mol/L醋酸钠溶液或双蒸消毒水中，－70℃至－80℃保存。