纤维素酶产生菌的发酵生产

任务4　纤维素酶产生菌的发酵生产

纤维素酶的生产和其他酶制剂一样，主要有固态发酵和液态深层发酵两种。固态发酵生产纤维素酶具有对设备要求不高，易操作，后续提取过程简单等优点，但劳动强度大，发酵水平不稳定。液态发酵生产纤维素酶具有机械化程度较高，不易被污染，发酵水平稳定和生产效率高等优点，但产酶活力较低，生产成本较高。

一、固态发酵生产纤维素酶

固态发酵设备简单，成本低，对环境危害小，易于推广，但放大比较困难，培养参数控制较复杂，容易感染杂菌。固态发酵需要经过原料的选取、原料的预处理、灭菌和接种、发酵培养等几个阶段。

1．原料的选取

一般的固态发酵，主要原料是麦麸，它含有足够的碳氮源和无机元素，又疏松适度利于通气，表面积大特别适合于好气性微生物生长。纤维素酶是一种诱导酶，纤维素就是最好的诱导物。在纤维素酶的固态发酵过程中，纤维质原料既可以用作碳源又可以作为诱导物。综合以上两种原料的优点，固态发酵生产纤维素酶一般采用麦麸和纤维质的混合原料（如秸秆粉）。氮源包括无机化合物，如尿素、（NH₄）₂SO₄，或者一些天然农产品（如糠）。

2．原料的预处理

纤维质原料的晶体结构和木质素的存在阻碍了微生物对其有效成分的利用，导致真菌对未处理的原料的利用极为缓慢。为了提高该过程的经济性，需要对原料进行有效的预处理，常用的方法包括物理法、化学法、生物法以及三种方法的综合利用，如机械粉碎、蒸汽爆破、酸碱处理以及微波处理。

侯丽丽等（2010）分别用微波、稀酸、稀碱、微波联合稀酸以及微波联合稀碱预处理稻草对后续固态发酵产纤维素酶的影响进行了比较，结果发现在基质浓度为7%的条件下，采用微波联合稀酸预处理（2%的H₂SO₄和180W的微波功率处理稻草5min），可得到最高的单位能耗的酶活力增加量，CMC酶活力和FPA酶活力最大值分别比未处理的稻草发酵后所得酶活力最大值提高了135．6%和82．7%。许宪松等（2006）以微波预处理后的稻壳为原料，用于固态发酵生产纤维素酶，可使滤纸酶活力（干基质）达7．09U／g，CMC酶活力（干基质）可达87．24U／g，分别比未经处理的稻壳提高了21%和15%。实验表明，经过处理的基质更易为菌体利用，表现为在发酵过程中菌体生长旺盛，酶活力提高；处理过程能够提高基质的酶活力，使得培养基中还原糖及可溶性糖的含量增加；对戊糖的含量无明显的提高作用。

3．灭菌和接种

培养基的灭菌需要在121℃下蒸汽灭菌30～60min，为了灭菌的彻底，固体培养基不要堆得太紧太厚。接种方式可分为孢子接种和种子悬浮液接种。种子悬浮液接种的固态发酵比直接用孢子接种的发酵产酶周期短，但种子悬浮液量不宜过大，若太大将影响产酶培养基的透气性，使产酶活力下降。种子悬浮液接种发酵产酶周期短的原因可能是由于种子悬浮液内含有一定量的糖苷酶，且接种总量大于孢子，分布也比较均匀，这种方式又称液固式发酵。

4．发酵培养

固态发酵过程中的培养基配方、培养基含水量、初始pH、接种方式、培养温度、发酵时间等因素及其相互作用对发酵有显著影响。对固态发酵而言，温度是首要因素。培养基及培养条件的优化，是降低酶制剂成本、提高酶活力、实现其工业化生产的重要措施。一般认为利用真菌进行固态发酵最好起始将培养基调为酸性，这样有利于真菌的生长而抑制细菌的滋生。固态发酵培养基的初始含水量，应视纤维素材料种类不同而异。

固态发酵工艺流程如图6－4所示。

图6－4　固态发酵生产纤维素酶工艺流程

二、液态深层发酵生产纤维素酶

固态发酵法有着根本上的缺陷，不能像液态发酵那样随着规模的扩大，成本大幅度下降。以秸秆为原料的固态发酵生产纤维素酶很难提取精制，目前生产厂家只能采用直接干燥粉碎得到固体酶制剂或用水浸泡后压滤得到液体酶制剂，产品外观粗糙（人称“垄糠酵素”），质量低且不稳定，杂质含量高；并且大多数菌株普遍存在着β－葡萄糖苷酶活力偏低的缺陷，致使纤维二糖积累，影响了酶解效率。因此，随着市场的成熟，液态发酵工艺的发展以及菌种性能的提高，采用液态深层发酵法生产纤维素酶是必然趋势。

液态深层发酵又称全面发酵，是将秸秆等原料粉碎、预处理至20目以下，灭菌后送至具有搅拌桨叶和通气系统的密闭发酵罐内，接入菌种，从发酵罐底部通入净化后的无菌空气或自吸的气流对物料进行气流搅拌，使气、液面积尽量加大而进行发酵。发酵完物料经压滤机压滤、超滤浓缩和喷雾干燥后得到纤维素酶产品。液态发酵虽有发酵动力消耗大、设备要求高等缺点，但具有液态发酵原料利用率高、生产条件易控制、产量高、工人劳动强度小、产品质量稳定、可大规模生产等优点。

1．培养基优化

纤维素酶是诱导酶，发酵过程中纤维素酶的大量合成必须有诱导物质的存在。纤维素、纤维低聚物及其他结构类似物均可作为纤维素酶的诱导物。为了降低成本，通常采用富含这些物质的木质纤维素原料为诱导物，如预处理过的秸秆、高粱秆等对纤维素酶均有很好的诱导效果，同时也可作为碳源。同时，无机盐离子、微量元素、表面活性剂、产酶促进剂、生长因子等的加入，也是生产高活力纤维素酶的必要条件。

有研究表明，在以纤维为主碳源的培养基中，加入一定量的乳糖、CaCO₃、鼠李糖脂、硫酸铵等物质，可以提高纤维素酶的活力。

2．过程优化和控制

温度、pH是影响细胞生长繁殖和发酵产酶的重要因素，而且由于纤维素酶产生菌多为好氧微生物，溶解氧量也是影响其发酵产酶的重要因素之一。通常菌种最佳生长和产酶所需温度、pH、溶解氧量并不相同，因此发酵过程中应对这3个参数分段调控。

另外，液态深层发酵的发酵时间约为70h，接种量明显低于固态发酵，其接种量一般为2%～10%体积分数。

为了提高菌株的浓度以及产酶量，可以采用流加发酵的方式向分批发酵过程中间歇或连续补加新鲜培养基。通常流加的物质是碳源、氮源等。在纤维素酶的液态发酵过程中采用此种形式，可在一定程度上（30%～50%）提高纤维素酶的活力。

3．液态深层发酵

液态深层发酵工艺流程如图6－5所示。

图6－5　液态深层发酵生产纤维素酶工艺流程

三、混合菌发酵生产纤维素酶

发酵生产纤维素酶时影响纤维素酶产量和酶活力的因素很多，主要包括菌种自身的特性、培养基组成及培养条件的差异等。为了提高纤维素酶活力和产量，很多学者在菌株选育及发酵工艺方面做了大量研究，但一直未有重大的突破，究其原因主要是因为纤维素的降解需要3种酶系协同作用，而目前采用的单菌产纤维素酶均存在酶系不完整和个别酶活力不高的缺陷。如目前公认较好的绿色木霉及其近缘菌株，普遍存在产生的β－葡萄糖苷酶活力偏低的缺陷。为了克服这个问题，根据微生物的微生态原理，混合菌发酵技术应运而生。

1．混合菌种搭配

纤维素的有效降解需要多种纤维素酶的协同作用，而纤维素酶是具有不同底物特异性的多酶系复合物，不同菌种产生的纤维素酶系不同，进行混合菌发酵时就可以弥补菌种之间的差异，产生多种不同功能的酶作用于纤维素的不同位点，充分发挥各酶之间的协同作用，大幅度提高纤维素酶的活性。因此，在选择不同菌种的组合时，所选的微生物之间应该是共生和互生关系，并且酶系互补和减弱酶的反馈抑制作用。目前采用的组合多为产纤维素酶菌之间的搭配，纤维素酶与其他产酶菌种（能产生分解木质素的酶）的搭配，以及纤维素酶和酵母菌（产蛋白）的搭配。

2．混合菌的比例

无论是哪种混合方式，是两种菌还是三种菌的混合，其间的比例合适与否对产酶量和酶活力都有较大的影响。如林志伟等（2009）、潘海波等（2007）、王振宇等（2007）分别研究了黄绿木霉菌株、黑曲霉和绿色木霉，绿色木霉和根霉，黑曲霉和绿色木霉之间的混合发酵，结果显示，当它们之间等比例混合时，所得酶活力最高。

3．发酵条件

混合菌发酵中存在多种菌种，其产酶的培养基组合、培养温度、发酵时间及pH不尽相同。因此，必须通过实验选择合适的条件，使各菌种之间得以协调，达到互相补充互相促进的目的，实现产酶及其活力的最大化。

对于混合菌的固态培养，还要考虑发酵培养基的初始含水量，该因素应视纤维素材料种类不同而异。玉米秸秆培养基适宜的含水量为1∶（2～2．5）（质量分数），麦秸培养基适宜的含水量为1∶（1～1．5），啤酒糟培养基的含水量为1∶1。

另外，在混合菌发酵生产纤维素酶的过程中，有时候还要考虑接种量和接种方法对产酶活力的影响。

四、固定化细胞发酵生产纤维素酶

微生物细胞的固定化是将休止细胞或生活细胞用物理化学的方法固定在某种水不溶性载体上，使之在一定的空间范围内进行生命活动（生长、繁殖和新陈代谢），是在固定化酶基础上迅速发展起来的一项新技术。

目前经常采用的生物固定化方法主要有吸附法、包埋法、交联法和共价结合法。其中，吸附法因其操作简单、固定化条件温和、细胞活性损失小、载体可以反复使用等优点，所以被广泛应用和深入研究。常用的载体有活性炭、氧化铝、高岭土、多孔玻璃、多孔陶瓷、多孔塑料等。采用这种方法将纤维素酶产生菌固定化后，固定化菌丝细胞可以在载体上保持一定的动态平衡，产酶能力稳定，至少可连续使用40d。在固定化细胞产酶过程中，诸如产酶周期、pH等因子的变化规律与游离细胞发酵基本相似，但酶活力明显提高，而且粗酶液中游离菌丝很少。如孙冬梅等（2006）报告，固定化细胞产CMC酶的酶活力明显高于游离细胞产CMC酶的酶活力，酶活力提高了177．6%之多。

采用固定化细胞发酵具有下列优点：①固定化细胞的密度较高，反应器的生产强度较大，可提高生产能力；②发酵稳定性好，可在较长时间内反复进行分批反应和连续反应，易于连续化、自动化生产；③微生物细胞固定在载体上，流失较少，可在高稀释率的情况下连续发酵，大大提高设备利用率；④发酵液中含菌量较少，利于产品分离纯化，提高产品质量等。

随着技术的更新，固定化原生质体发酵也逐渐发展起来，其具体在纤维素酶生产上的应用还有待进一步研究。