真菌的分离和培养

一、真菌分离培养

真菌培养是疾病诊断中的重要环节，培养出致病真菌是进一步鉴定菌种的前提条件。真菌培养第一步是从临床标本中培养真菌的初代培养，初代培养后进一步进行分离纯化培养和鉴定培养。不同致病真菌每一步所采用的培养基，培养时间和培养温度存在一定的差异。常规的真菌培养需要在28～30℃温度下培养3～4周，一般初代培养选用沙氏培养基（SDA）或者马铃薯琼脂培养基（PDA），采用试管培养，一般同时培养两管，其中一管可添加抗生素（氯霉素或庆大霉素均可）。在培养1周内，应该每天观察有无真菌生长。一般培养4周后，如果无真菌生长可报阴性。发现培养出真菌，直接挑取少量菌体或者培养后，用乳酸酚棉兰制成涂片显微镜下观察，结合菌落大体形态，典型菌种可直接报告种属。不典型菌种根据基本表现，采用适当的标准鉴定培养基，标准培养条件培养，必要时要结合生理学和分子生物学方法进行鉴定。

常用真菌培养基有沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂，沙堡弱培养基，沙氏液体培养基，马铃薯葡萄糖琼脂等。

二、真菌鉴定

对常见致病真菌要掌握的鉴定原则是首先区分酵母菌和霉菌。如果初代培养基上培养出酵母样菌落，在鉴定前应进行分离纯化。在去除细菌和其他真菌污染，区分混合感染后，对纯菌落进行鉴定。酵母菌鉴定主要根据形态学特征和生理生化特点，按照一定的流程进行。首先根据菌落颜色进行分类。

霉菌的鉴定非常复杂，有许多标准包括形态学特征、温度耐受性，放线菌酮抗性、双相性、营养需求、蛋白分解活动以及水解尿素能力等。现代分类学鉴定方法主要依据分生孢子的个体发生过程结合其他特征来进行鉴定。初代培养后根据形态学特征一般可鉴定到属的水平，再依据不同真菌的鉴定要求，采用标准培养基和培养条件进一步完成菌种鉴定。例如：曲霉属鉴定时需要采用标准培养基，即察氏培养基和麦芽琼脂，25℃培养7天后与曲霉形态鉴定检索表对应得到正确的结果。

1.形态学鉴定

菌落形态观察 致病真菌的形态学鉴定的第一步就是要区别不同的菌落特征。即酵母型菌落或丝状型（霉菌）菌落。对霉菌通常采用形态学鉴定为主, 而酵母菌常需采用形态和生理相结合的手段。观察真菌菌落时应注意菌落大小、形态、色素、颜色和质地。

显微镜检查 为充分在镜下观察真菌结构，必须用分离针挑出一部分菌落进行观察。常用乳酸酚苯胺蓝(LPCB，棉蓝)对挑取的部分菌落进行染色。此项操作必须在生物安全柜中进行。样本需要保存时可用指甲油封边。覆盖培养、透明胶带法等均是常用的方法。

玻片培养 是一种特殊的玻片作成的培养小室，可以更为清楚地观察真菌孢子和分生孢子的形成及位置。涉及小培养的所有操作均应在生物安全柜中进行。可选用马铃薯琼脂和玉米琼脂做培养基。

用表型特征对真菌进行分类鉴定，仍然是目前临床实验室普遍应用的方法。对致病真菌的鉴定，需要选择合适的培养基进行培养后，再借助光学显微镜，加上荧光显微镜、电子显微镜和细胞化学等各种染色法观察形态特点。

2.分子生物学鉴定

应用分子生物学技术从遗传和进化角度阐明真菌菌种之间和种间内在关系是目前真菌分类研究热点，已普遍应用于真菌现代分类鉴定之中。

由于真菌培养和鉴定需要的时间较长，阳性率较低，因此与分子生物学相关的从临床标本直接检测真菌的技术和方法也在不断发展中，应用最多的为PCR技术，具有快速、敏感等特点。在进行扩增之前，应当对标本进行处理以去除影响扩增效率的一些因子。在PCR扩增检测中，有传统的PCR方法，也有巢式PCR法，最近应用较多的是实时定量PCR方法，其敏感性和特异性较好，在真菌鉴定、检测上有较广阔的应用前景。

三、注意事项

1.霉菌孢子容易飞散而造成污染，霉菌分离培养应在单独的实验室中进行。尽量保持实验室安静，减少空气流动。

2.霉菌实验室不能使用布或类似的纤维材料的窗帘，不能在直射阳光下配制、分装稀释液、倾注平板以及取样等，最好能安排流水作业，以使从稀释第一份样品到倾注最后一个平皿所用时间不超过20分钟，以免对分离培养结果造成误差。

3.霉菌所固有的蔓延生长特性，保存菌种应选用耐高压的塑料套式试管帽，不应使用棉塞，以免造成菌种交叉污染。

4.每次实验前，对有可能导致霉菌污染的材料，应认真全面消毒。做完实验后，尤其是大量培养后，除在第一时间将霉菌培养物灭菌外，还要对培养箱、接种箱、实验室进行消毒。霉菌孢子对紫外线抵抗力较强，所以通常以甲醛熏蒸，严重污染时可用10%甲醛喷雾。