发状念珠藻细胞分离纯化

6．1　发状念珠藻细胞分离纯化

将干燥的发状念珠藻浸泡在BG11₀培养基中，置光照培养箱中40 μmol· m^－2· s^－1，25℃静置培养10小时，使其光合活性完全恢复。将发状念珠藻剪成约1cm长的节段，置于一灭菌烧杯中，加入0．1% HgCl₂浸泡30～60秒进行表面消毒，倒出HgCl₂溶液，用无菌水冲洗5～6次。把经表面消毒的发状念珠藻段加入无菌BG11₀培养基中，在玻璃匀浆器中匀浆成浆液。将发状念珠藻浆液接入BG11₀培养基中，调整培养基pH值为7．5，光照强度40μmol· m^－2· s^－1，25℃静置培养30～40天。

天然发状念珠藻匀浆后分离得到的单体细胞多数呈典型的念珠状排列（藻丝），由于匀浆所产生的机械破坏作用，匀浆液中的藻丝与天然发状念珠藻相比较短，匀浆液中还可见一些游离的单细胞及胶质鞘的碎片（彩色插图10）。分离后的细胞在培养过程中，部分细胞死亡，藻丝数量逐渐减少，而单细胞则逐渐增多。单细胞主要为厚壁孢子和异形胞，壁厚，折光性较强，说明发状念珠藻细胞由聚合体中分离出来进行液体培养时，多数营养细胞不能适应这一改变而死亡或转变为厚壁孢子。细胞培养物以30～40天为一周期连续转代后，培养液中的念珠状细胞又逐渐增加，表明发状念珠藻细胞已逐渐适应液体培养环境，细胞颜色也由最初的黄绿色逐渐变为深绿色，说明细胞内叶绿素含量有所增加。

BG11₀液体培养基中加入1%的琼脂，制备BG11₀培养基平板。吸取上述发状念珠藻细胞培养液涂布于平板上，光照培养箱中40μmol· m^－2· s^－1，25℃培养10～15天，平板上可形成绿色细胞群落（彩色插图11），从中选取分离的细胞群落，镜检确定为典型发状念珠藻细胞纯培养物后，接入BG11₀液体培养基中，以30天为一个培养周期连续传代培养，培养过程中镜检，确定培养液中无其他微生物和藻类的生长，将此细胞培养物作为发状念珠藻细胞种，培养在BG11₀培养基中，15μmol· m^－2· s^－1光照，15℃下保存，40～60天转接一次。