细菌群体感应的快速筛选

实验二十二　细菌群体感应的快速筛选

一、实验目的

（1）了解细菌群体感应的检测原理。

（2）掌握细菌群体感应的检测方法，为基于细菌群体感应抑制剂的筛选提供指导。

二、实验原理

群体感应（quorum sensing）是指细菌向环境中分泌、释放一些小分子量的化学信号分子促进细菌个体间的相互交流，协调群体行为从而调节微生物生理特性的机制。紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）紫色素的合成机制受细菌群体感应的调控。紫色色杆菌突变株CV026为ATCC31532的mini－Tn5突变体，不能合成AI－1信号分子（酰基高丝氨酸内酯类化合物，AHLs），因而不能产生紫色色素；当外源环境中存在较高浓度的AHLs，菌体会产生特征性的紫色色素，指征细菌群体感应调控的相关基因表达。Agrobacterium tumefaciens A136（pCF218／pCF372）含有ptra I－lac Z融合基因和traR基因，细胞自身不合成高丝氨酸内酯。当环境中存在信号分子时，TraR5与信号分子结合从而启动启动子的转录，进而使lac Z基因表达半乳糖酶，从而使培养基（加入有X－gal）变蓝色。Ⅱ类信号分子即自诱导物AI－2（呋喃硼酸二酯类化合物），首先在哈氏弧菌（Vibrio harveyi）群体感应系统时发现。用于检测AI－2的指示菌是哈氏弧菌BB170，能特异性地检测环境中的Ⅱ类信号分子并生物发光，通过检测光强度方法可以方便地检测出目标菌是否能产生Ⅱ类信号分子或者样品中是否含有此类信号分子。哈氏弧菌BB152（autoinducer1－，autoinducer2＋）为AI－1缺陷型，可产生AI－2，实验中作为阳性对照。

三、实验器材

（1）菌种：紫色杆菌（Chromobacterium violaceum）CV026，根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）A136，哈氏弧菌（Vibrio harveyi）BB170，哈氏弧菌（Vibrio harveyi） BB152，待测样品。

（2）培养基：液体LB培养基、固体LB培养基、LM培养基、AB培养基。

（3）抗生素：A136菌种培养用壮观霉素（Sp）50μg／mL、四环素（Tc）4．5μg／mL。CV026菌种培养用卡那霉素（Km）20μg／mL。

（4）仪器：恒温培养箱、恒温调速摇床、移液枪、pH计、电子天平、电热鼓风干燥箱、无菌操作台、电磁炉、－80℃冰箱、－20℃冰箱、台式高速冷冻离心机、微生物高通量筛选系统—荧光检测仪、0．22微米滤膜、1mL一次性无菌注射。

（5）其他：培养皿、三角瓶、打孔器。

四、实验步骤

（一）高丝氨酸内酯类信号分子（AI－1）检测

1．平行划线法

（1）指示菌（CV026或A136）与待测菌过夜活化培养，培养基中加入相应的抗生素。

（2）用接种环或牙签（灭菌）分别挑取指示菌和待测菌在LB平板上平行划线。

（3）指示菌本身作阴性对照，分别用C6和C8的信号分子作阳性对照。

（4）用A136为指示菌时固体LB中加入终浓度为50μg／mL的X－gal。

（5）将划好的平板倒置于30℃的恒温培养箱中过夜培养。

示意图如下：

图22－1　平板划线检测法

2．打孔法检测法

（1）培养液提取物的制备：待测菌过夜培养，离心获得10mL上清液，用等体积的乙酸乙酯提取3次，有机相合并后，35℃旋转蒸干，再用适量的甲醇溶出（1～2mL），得粗提物。

（2）报告平板制备：LB固体培养基加热熔化，待冷却至45℃左右加入10mL过夜培养的指示菌CV026或A136（加入终浓度为50μg／mL的X－gal）混匀后立即倒平板。待凝固后，用直径为6mm的打孔器（经灭菌处理）在平板上均匀打孔，在每孔中加入50μL上述提取液。30℃正置培养18h左右，观察结果。

示意图如下：

图22－2　打孔检测法

（二）AI－2类信号分子的检测

（1）待测菌活化培养后无菌过滤得到无细胞上清液，样品置－20℃保存。

（2）哈氏弧菌BB152的活化培养：将储存于－80℃的甘油管菌种按1%的接种比例接种于LM培养基中，30℃，220r／min振荡培养过夜。

（3）将培养过夜的菌液以1%的比例接种于新鲜的AB培养基中培养过夜，取1～2mL用0．22μm无菌水膜过滤，得到阳性对照样品（AI－2－like fluids）置－20℃保存。

（4）哈氏弧菌BB170的活化培养：将储存于－80℃的甘油管菌种按1%的接种比例接种于LM培养基中，30℃，220r／min培养过夜（12～16h）。

（5）以1%的比例接种BB170于新鲜的AB培养基中，再次培养过夜。

（6）将指示菌BB170用新鲜的AB培养基稀释5 000倍后加入到96孔板中，加入量为80μL。

（7）将样品以及制得的阳性对照样（AI－2－like－fluids）加入到相应的孔中，加入量均为20μL。

（8）将96孔板放入高通量检测仪进行发光强度检测。

（9）数据记录与处理。

图22－3　BB170活化示意

五、实验记录

（1）平板划线法中指示菌菌落变色情况。

（2）打孔法实验中蓝色圈是否形成，测量直径。

（3）AI－2测定实验生物发光强度数据记录。

六、思考题

（1）进行菌种活化时为什么要进行2次活化？在进行二类信号分子检测时为什么最后要稀释5 000倍？

（2）为什么可以用农杆菌和紫杆菌作为指示菌检测信号分子，它们的检测原理是什么？

（3）用哈氏弧菌BB170作为指示菌检测时，发现结果不是预设的那样，可能的问题出在哪里？

（4）在所有的实验操作过程中有哪些注意事项。

参考文献

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