重组病毒的筛选

实验十五　重组病毒的筛选

一、实验目的

掌握用脂质体法将带有目的基因的重组载体导入细胞;掌握筛选重组病毒的方法。

二、实验原理

脂质体法是利用脂质体将带有目的基因的重组载体转入细胞。外源基因进入细胞主要有四种方法:电击法、磷酸钙法脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上暂时性穿孔让外源质粒进入;磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法，使外源基因进入细胞;病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法以使外源基因进入细胞。电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大;病毒法的前期准备较复杂，而且可能对于细胞有较大影响;所以现在对于很多普通细胞系，一般多采用脂质体法。

脂质体是一种人工膜，用于转移DNA的较理想的膜成分是带负电荷的磷脂酰丝氨酸。脂质体的制备方法很多，其中以反相蒸发法最适于包装DNA。做法大致是:将磷脂和DNA溶液溶解于大量的有机溶剂(如醚)中，再经过超声波处理，使其形成乳剂，然后蒸发掉有机溶剂，最终形成0.4μm的脂质体。

脂质体与质粒的比例、细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要因素，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。

在腺病毒载体pAd5C (通常缺失E1基因区)中插入目的基因HA构成腺病毒穿梭质粒pAd5C/HA，与带有腺病毒全基因组(通常缺失E1基因区)的AD5基因组DNA片段，共同转染携带E1基因区的细胞，如293细胞，在293细胞内通过同源重组形成重组腺病毒基因组，并包装成病毒颗粒。此法的主要缺点是重组效率比较低。

病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆。因此利用有限稀释以及空斑纯化可获得重组病毒。

三、实验材料

重组病毒、EcoRI酶、琼脂糖、玻璃粉、脂质体、293细胞、PCR仪。

四、实验步骤

(1)用EcoRI酶切AD5基因组DNA。

(2)琼脂糖电泳后用玻璃粉法回收3个片段中最大的片段(操作步骤见实验五)。

(3)在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基，加入回收的大片段与pAd5C/HA，震荡后选择合适的混合比例(1∶1～1∶2/脂质体体积:DNA质量)加入合适体积的转染试剂。

(4)将混合液在室温放置10～15min。

(5)吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。

(6)加入混合液，将细胞放回培养箱中培养1h;移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24～48h。

(7)收集转染后的细胞，3次冻融之后接种HeLa细胞，48h后收获病变的细胞，冻融3次后离心去除细胞碎片，取上清液作为模板进行PCR检测。

(8)野生型腺病毒感染的HeLa细胞采用同样方法处理后作为阴性对照。

五、方法评注

基因转染正逐渐成为研究基因功能，研究人类疾病机制以及临床治疗中重要的手段。寻找效率高而毒性低的基因转染法则是临床应用的关键所在。

目前将外源基因导入真核细胞的方法有很多，一般可分为两大类:病毒转染法和非病毒转染法。病毒转染法存在着安全和技术方面的缺点，非病毒转染法(包括磷酸钙沉淀法、DEAE-葡萄糖法、脂质体转染法和电穿孔法等)被认为是目前比较安全的方法。