重组的构建和筛选

基本的重组DNA技术操作过程，也可形象地归纳为“分、切、接、转、筛”，即分离目的基因、限制酶切目的基因与载体、拼接重组体、转入宿主细胞、筛选重组体。图13－9是以质粒为载体进行DNA克隆的模式图。

（一）目的基因的获取——分

获取目的基因大致有如下几种途径或来源。

1．化学合成法 如果已知某种基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出编码该多肽链的核苷酸序列，可利用DNA合成仪通过化学合成法合成目的基因。一般用于小分子活性多肽基因的合成。

2．基因组DNA文库 分离组织或细胞染色体DNA，利用限制性内切核酸酶（如Sau 3AⅠ或MboⅠ）将染色体DNA切割成基因水平的许多片段，与适当的克隆载体拼接成重组DNA分子，继而转入受体菌扩增，使每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。不同细菌所包含的重组DNA分子内可能存在不同的染色体DNA片段，这样生长的全部细菌所携带的各种染色体片段就代表了整个基因组。存在于转化细菌内、由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称基因组DNA文库（genomic DNA library）。从基因组DNA文库中获得目的基因，需结合适当筛选方法从众多转化子菌落中选出含有某一基因的菌落，再行扩增，将重组DNA分离、回收，获得目的基因的无性繁殖系——克隆。

3．cDNA文库 以细胞mRNA为模板，获得双链cDNA片段后，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库（cDNA library）。与上述基因组DNA文库类似，需要采用适当方法从cDNA文库中筛选出目的cDNA。

4．聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） 目前最常用的获取目的DNA的方法。PCR是一种在体外利用酶促反应获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术。要获得目的基因，除PCR技术的通用条件外，还必须知道目的基因5′－端、3′－端的各一段核苷酸序列及其他相关条件，以设计出合适的引物。

（二）载体的选择和构建——选

根据目的不同选择载体，如果为了获得目的DNA片段则选用克隆载体，如果为了获得目的基因编码的蛋白质则选择表达载体。除此之外，还需考虑目的DNA的大小要与载体的容量相匹配、载体多克隆位点中所含限制性内切酶是否适用于目的基因等。在重组DNA技术中，可以根据目的不同、操作基因的性质不同选择不同的载体和改建方法。

（三）目的DNA与载体连接——接

将目的DNA片段与载体连接在一起，即DNA的体外重组，这种人工DNA重组是由DNA连接酶完成的。根据目的DNA片段与载体的末端不同，有如下连接策略。

1．黏性末端连接 包括以下几种连接方式。

（1）同一限制酶切位点连接：目的DNA片段和载体的两端由同一限制性内切核酸酶切割生成具有完全相同的末端。这样连接时会产生3种结果：载体自连、目的DNA片段自连、载体与目的DNA连接（正向和反向插入）。这种策略并不能很高效地获得正确的重组体。

（2）不同限制性内切核酸酶位点连接：由两种不同的限制性内切核酸酶分别切割目的DNA片段和载体的两端，这样可在两端产生不同的黏性末端，从而使目的DNA片段可以定向插入载体。这种克隆方法称为定向克隆（directed cloning），可有效避免载体自连以及目的DNA片段的反向插入和多拷贝现象。当然定向克隆也可通过一端为平端，另一端为黏性末端的连接方式实现。

（3）用其他方法获得黏性末端进行连接：由于平端连接的效率不高，常用别的方法为平端制造出黏性末端，具体有如下方法。

1）人工接头法：平端DNA片段或载体DNA，可在连接前将含有限制性内切核酸酶位点的人工合成接头（linker）或适当分子连到平末端，再用相应的限制性内切核酸酶切除接头的远端，产生黏性末端进行连接。

2）同聚物加尾法：在末端转移酶（terminal transferase）作用下，在目的DNA片段末端加上同聚物序列（如dA），同时在载体对应的末端加上互补的同聚物序列（如dT），互补的同聚物尾为黏性末端，可高效连接，是属于黏性末端连接的一种特殊形式（图13－10）。

图13－10 同聚物加尾法连接

3）PCR法：针对目的DNA设计一对引物，分别包含了不同的限制性内切酶位点，PCR扩增后可获得带有引物序列的目的DNA，应用对应的限制性内切酶切割产生相应的黏性末端，即可与带有相同黏性末端的线性化载体有效连接。由于PCR中常用的Taq DNA聚合酶反应后的产物3′－端可加上一个单独的腺苷酸（A），这样的产物可直接与带有3′－T的线性T载体在T4DNA连接酶作用下直接连接，此即T－A克隆。在此基础上又发展了Topo T－A克隆法，其原理与T－A克隆类似，不同的是使用的连接酶为DNA拓扑异构酶，由于此酶的连接效率很高，整个连接反应通常只需5min。

2．平端连接 若目的DNA和载体的两端均为平端，也可在DNA连接酶催化下连接。平端连接的效率较低，可通过提高连接酶用量、延长反应时间、降低反应温度、增加DNA片段与载体摩尔比等措施来提高效率。平端连接也存在载体自身环化、目的DNA双向插入、目的DNA自连接以及多拷贝等缺点。

3．黏－平连接 目的DNA和载体之间通过一端黏性连接、另一端平端连接。目的DNA可定向插入载体，其效率介于黏性末端连接与平端连接之间，可采用提高平端连接效率的措施来提高连接效率。

（四）重组DNA导入受体细胞——转

连接完成的重组DNA分子需将其导入宿主细胞才能实现扩增。基因工程中使用的宿主细胞通常为DNA/蛋白质降解系统缺陷株和（或）重组酶缺陷株，对外源DNA有较强的接纳能力，可保证外源DNA长期稳定地遗传或表达，这样的宿主细胞称为工程细胞。重组DNA进入宿主细胞有如下常用方法。

1．转化（transformation） 重组DNA直接导入细菌和酵母等宿主细胞的方法，通常是比较小的质粒和黏粒会选用这种方法。根据目的选用合适的宿主细胞后，用适当的理化方法处理宿主细胞，使其细胞膜通透性增加，处于最适摄取和容忍重组体的状态，即成感受态细胞（competent cell）。实现转化的方法包括化学诱导法（如氯化钙法）、电穿孔（electroporation）等。

2．转染（transfection） 重组DNA直接导入真核细胞（酵母除外）的过程称为转染，是常用的化学方法（磷酸钙共沉淀法、脂质体融合法等）和物理方法（显微注射法、电穿孔法等）。

3．感染（infection） 以噬菌体载体或黏粒载体构建的重组DNA分子，可包装成病毒颗粒，以感染的方式将重组DNA转入受体菌。用逆转录病毒、腺病毒等为载体构建的重组DNA，可经包装细胞包装成病毒颗粒，以感染的方式将DNA导入真核细胞（通常是哺乳类细胞）。

（五）重组体的筛选——筛

重组DNA分子被导入受体细胞后，需要设法将众多的转化菌落或菌斑区分开来，并鉴定得到目的基因的克隆，这一过程即为筛选（screening）。根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细胞表达情况不同，可采取遗传标志筛选、序列特异性筛选与亲和筛选等方法。

1．遗传标志筛选

（1）抗生素标志筛选：如果克隆载体携带有某种抗生素标志基因，如氨苄西林抗性基因ampr或卡纳抗性基因kanr，将转化后的宿主细胞放在含该抗生素的培养板上培养，含有载体的宿主细胞就可以生长，反之不能。

如图13－11，如果载体上有2个抗生素标志基因，可先用氨苄西林平板筛选出含有载体的克隆，如果重组DNA时外源DNA片段插入标志基因（四环素抗性基因）内，标志基因失活，通过有与无抗生素（四环素）培养基对比培养，还可区分单纯载体或重组载体（含外源基因）的转化菌落。

（2）标志补救（marker rescue）：若重组DNA上有基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主细胞的相应缺陷互补，使得宿主细胞能在相应的选择性培养基中存活进行筛选，这就是标志补救。

利用α互补筛选携带重组质粒的细菌就是一种标志补救选择方法。关于α互补原理在本章第二节已有介绍，这里以质粒pUC18作载体为例，概括说明将外源基因插入载体lacZ基因N－端序列时是如何进行筛选的（图13－12）。

2．序列特异性筛选

（1）限制性内切核酸酶酶切法：针对初筛为阳性的克隆，提取重组DNA，用合适的限制性内切核酸酶消化，根据琼脂糖电泳可判断是否有目的DNA片段的插入；根据插入片段内部不对称的限制性内切核酸酶位点，可用相应的酶处理后，根据酶切片段的大小判断插入DNA的方向是否正确。

（2）PCR法：利用序列特异性引物，通过PCR扩增后，可鉴定出是否含有目的DNA片段，结合序列分析，便能可靠地获得插入DNA片段的方向、序列和阅读框的信息。

（3）核酸杂交法：利用带标记的DNA探针与转移至硝酸纤维素膜上克隆的DNA片段进行分子杂交，直接选择并鉴定目的基因。

图13－11 利用插入失活（选择性抗性）筛选带有重组载体的克隆

3．亲和筛选 如果重组DNA进入宿主细胞后能表达其编码产物，可利用抗原－抗体反应或配体－受体反应来筛选。与核酸杂交方法类似，区别在于将吸附在硝酸纤维素膜上的DNA换成了蛋白质，检测探针换为带标记的抗体/抗原或配体/受体。

（六）克隆基因的表达

重组DNA技术不仅用于获得大量的目的DNA片段，还可进行目的基因的表达，实现生命科学研究、医药或商业目的，亦即基因工程的最终目标。克隆的目的基因正确而大量表达有特殊意义的蛋白质已成为重组DNA技术中一个专门的领域，包括表达载体的构建、受体细胞的建立及表达产物的分离纯化等技术和策略。基因工程的表达系统包括原核和真核表达体系。

1．原核表达体系 大肠埃希菌是当前采用最多的原核表达体系，其优点是培养方法简单、迅速、经济而又适合大规模生产工艺。适合大肠埃希菌的表达载体应具有：①大肠埃希菌适宜的选择标志；②能调控转录、产生大量mRNA的强启动子，如lac、tac启动子或其他启动子序列；③适当的翻译控制序列，如核糖体结合位点（ribosome binding site）和翻译起始点等；④含有合理设计的多接头克隆位点（polylinker cloning site），以确保目的基因按一定方向与载体正确衔接。

图13－12 蓝－白筛选带有重组载体的克隆

通常表达蛋白在产量高的同时，还要求表达产物易于分离、纯化。较常用的策略是在目的基因前连上一个编码标签肽的序列，即表达融合蛋白。在这种情况下表达的蛋白质多为不溶性的包涵体（inclusion body），极易与菌体蛋白分离。某些标签肽还有针对性的亲和层析柱用于表达产物的分离、纯化。如果在设计融合基因时，在目的基因与附加序列之间加入适当的裂解位点，则很容易从表达的杂合分子中去除附加序列。如果表达的蛋白质是考虑蛋白质的功能或生物学活性，用于生物化学、细胞生物学研究或临床应用，除分离、纯化方便，表达可溶性蛋白质往往是必需的；如果表达的是包涵体形式，还需在分离后进行复性或折叠。

大肠埃希菌表达体系在实际应用中尚有一些不足之处：①由于缺乏转录后加工机制，大肠埃希菌表达体系只能表达克隆的cDNA，不宜表达真核基因组DNA；②由于缺乏适当的翻译后加工机制，大肠埃希菌表达体系表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰；③表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，欲使其具有活性尚需进行复杂的复性处理；④很难在大肠埃希菌表达体系表达大量的可溶性蛋白。

2．真核表达体系 除了与原核表达体系有相似之处外，真核表达载体通常含有选择标记、启动子、转录翻译终止信号、mRNA加poly（A）信号或染色体整合位点等。真核表达体系的缺点是操作技术难、费时、费钱。

真核表达系统包括酵母、昆虫及哺乳类动物细胞3类表达体系。例如哺乳类动物细胞不仅可表达克隆的cDNA，还可表达真核基因组DNA；哺乳类细胞表达的蛋白质通常总是被适当修饰，而且表达的蛋白质会恰当地分布在细胞内一定区域并积累。