重组质粒的转化和重组菌的筛选

实验八　重组质粒的转化和重组菌的筛选

一、实验目的

学习重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞的方法，理解α互补筛选的基本原理。

二、实验原理

已经制备好的感受态细胞膜外表被Ca²⁺覆盖，带负电荷的DNA分子容易接近。但细胞膜静止状态是封闭的。因此先将DNA与Ca²⁺屏蔽的大肠杆菌混合，静置在0℃，使DNA分子充分接近细菌表面，然后突然短暂加温到42℃，使细胞膜运动加剧，出现瞬时小孔，附近的DNA分子可以迅速进入细胞。由于质粒DNA含有使抗生素失效的酶基因，转化有质粒DNA的细菌可以在含有该种抗生素的培养基上生长，所以将转化后的细菌铺在含该抗生素的培养基上筛选阳性菌落。没有插入的质粒可以在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下合成β-半乳糖苷酶片段，与宿主细胞编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补，对培养基中的生色底物5-溴4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)作用，生成蓝色。而由于重组质粒中插入片段是插在LacZ基因中，打断了它编码的β-半乳糖苷酶氨基端片段的完整性，就不能生成蓝色。所以含有重组质粒的是白色菌落，含有未插入外源DNA质粒的菌落是蓝色的。

图8-1　pUC19质粒结构

图8-2　LacZ基因的结构和重组子的筛选

三、实验仪器、材料和试剂

1.仪器:离心管(1.5mL、7mL)，台式高速离心机，微量移液器，枪头(1mL、200μL)，枪头盒，恒温摇床，恒温培养箱，超净工作台，涂棒，酒精灯，水浴锅，制冰机和冰盒。

2.材料:大肠杆菌DH5α感受态细胞，连接好的重组质粒(连接产物)。

3.试剂:含Amp抗生素的固体培养基(平板)，无抗生素的液体LB培养基。

四、实验步骤

1.将水浴锅温度调至42℃。

2.取连接产物适量(根据量决定，可以取5μL或10μL)与分装好的100μL感受态细胞用拨打离心管底部的方法混匀，放在浮子上，在水浴锅附近，以减少将转化混合物从冰上到热激过程中的震荡。在冰上放置30min。

3.将混合有质粒的感受态细胞的离心管在42℃水浴锅严格地静止保温90s，取出后在冰上放置2min。

4.在转化后的离心管中加入100μL无抗生素的液体LB培养基，37℃恒温摇床摇30～60min。

5.将转化后的菌液取100μL铺在一个含抗生素的固体培养基平板上，或全部200μL铺在一个含抗生素的固体培养基平板上。37℃过夜培养16h后记数。

实验需要约2h。

五、结果与分析

统计在培养基上长出的白色和蓝色菌落数，其中蓝色菌落是没有插入外源DNA的质粒转化所形成，白色菌落含有插入外源片段的质粒。

六、注意事项

42℃中严格保温90s，不能过长或过短，温度也要严格在42℃，保温时要静止，不能扰动。

七、思考题

1.为什么一定在42℃中严格保温90s，时间不能长也不能短，温度不能高或低?

2.保温时为什么不能扰动转化体系?