动物细胞培养用液的配制

动物细胞培养用液的配制_动物细胞培养技术

任务3　动物细胞培养用液的配制

培养用液是维护组织、细胞生存、生长及进行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶液，主要包括平衡盐溶液、培养基、杂用液（其他培养用液）三大类，培养基又分为天然培养基与合成培养基。

平衡盐溶液（balanced salt solution，BSS）具有维持渗透压，调控酸、碱平衡的作用，并可提供细胞生存所需的能量和无机离子成分，另外，还可用做洗涤组织、细胞以及配制各种培养用液的基础溶液。它是制备细胞、培养细胞及检查细胞所必需的，可为细胞培养提供方便、有利的条件。

天然培养基主要是来自动物的体液或从组织中分离提取的成分，其营养性高，成分复杂，但来源受限，而且存在较大的个体差异。合成培养基是模拟人或动物体内环境合成的，配方恒定，是较为理想的培养基，但需与天然培养基混合使用，才能使细胞生长和繁殖。培养基是细胞生存的环境，其使用要求严格，对其各种成分需要精心选择。

一、水及平衡盐溶液

（一）细胞培养对水的要求

水不仅是细胞的主要成分，也是细胞赖以生存的主要环境，营养物质、代谢产物都必须溶解在水中，才能被细胞吸收和排泄。普通自来水含有大量离子和杂质，对细胞生长不利，甚至会引起细胞死亡。因此，培养细胞所用的水必须高度纯化。水的纯度不够，即使有害元素含量极少，对细胞也会产生不利的影响，因此配制所有的培养液和各种溶液都应使用三蒸水。三蒸水的储存对保持水的质量有很大影响，周围环境和空气能使水污染或改变其pH值，所以对于储存水的容器要尽量减少开启的次数，避免和外界多接触，存放时间不宜太长，一般不要超过两周，最好现制现用。

（二）平衡盐溶液

平衡盐溶液主要由无机盐、葡萄糖组成，它的作用是维持细胞渗透压平衡，保持pH值稳定及提供简单的营养。平衡盐溶液主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。表1-6为几种常用的平衡盐溶液的配方。

表1-6　几种常用的平衡盐溶液的配方（单位：g／L）

最简单的平衡盐溶液是Ringer。D-Hank′s与Hank′s的一个主要区别在于前者不含Ca^2＋、Mg^2＋，因此D-Hank′s常用于配制胰蛋白酶溶液。Earle平衡盐溶液具有较高的NaHCO₃浓度（2.2g／L），适合于5%CO₂的培养条件，Hank′s平衡盐溶液仅含0.35g／L NaHCO₃，不能用于5%CO₂的环境，若放入CO₂培养箱，溶液将迅速变酸，使用时应注意。

配制平衡盐溶液也应当用三蒸水。如果配方中含有Ca^2＋、Mg^2＋，应当首先溶解这些成分，配好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高温、高压灭菌。

二、培养基

细胞在体外的生存环境是人工模拟的，除了必须提供适当的温度、空气、无菌等条件外，最重要的是使细胞赖以生存的培养基接近于体内的生理环境，保证细胞能够正常地生存、生长，并维持其结构及功能。培养基的种类很多，按其来源，分为天然培养基和合成培养基；按其基质状态，分为半固体培养基和液体培养基等。

（一）培养基的基本要求

体外培养的细胞直接生长于培养基中，因此培养基应能满足细胞对营养成分、生长因子、激素、渗透压、pH值等诸多方面的要求。

1.营养成分

细胞在体外生长，首先应满足其生存所需的营养条件。细胞对营养的需求包括以下几个方面。

（1）氨基酸：氨基酸是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要以下12种必需氨基酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸，这些氨基酸都是L型的。此外，还需要谷氨酰胺，谷氨酰胺在细胞代谢过程中具有重要的作用，不仅能促进各种氨基酸进入细胞膜，而且是碱基嘌呤和嘧啶合成时的氮源，在合成一磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷时也是必需的。

（2）单糖：培养中的细胞可进行有氧酵解和无氧酵解，六碳糖是主要的能源。此外，六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。细胞对各种糖的吸收能力不同，葡萄糖最高，半乳糖最低。

（3）维生素：维生素在细胞代谢过程中主要扮演辅酶、辅基的角色，因此是必不可少的。生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B₁₂等都是培养基中常有的成分。

（4）无机离子与微量元素：细胞生长过程除需钠、钾、钙、镁、氮和磷等基本元素外，还需要一些微量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。

2.生长因子及激素

细胞在体内的生长随时受到激素、生长因子的调节，在体外生长同样离不开激素类物质和各种生长因子。越来越多的实验证明，各种激素、生长因子对于维持细胞的功能、保持细胞的状态（分化的或未分化的）具有十分重要的作用。有些激素对许多细胞有促生长作用，如胰岛素（insulin），它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素对某一类细胞有明显促进作用，如氢化可的松（hydrocortisone）可促进表皮细胞的生长，泌乳素（prolactin）有促进乳腺上皮细胞生长的作用等。各种生长因子的作用就更加明显并具有特异性。随着研究工作的深入，目前已发现了多种细胞生长因子，并可从血清、各种组织和生物成分中提取，或用基因工程的方法获得。

3.渗透压

细胞必须生长在等渗的环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。人血浆渗透压约为290mOsm／kg，可视为培养人体细胞的理想渗透压。鼠细胞渗透压在320 mOsm／kg左右。对于大多数哺乳类动物细胞，渗透压在260～320mOsm／kg的范围内都适宜。

4.pH值

大多数细胞的适宜pH值为7.2～7.4，偏离此范围对细胞会产生有害影响，培养基应具有一定的缓冲能力。造成培养基pH值波动的主要物质是细胞代谢产生的CO₂，在封闭式培养过程中，CO₂与水结合产生碳酸，培养基pH值很快下降。为了解决这一问题，合成培养基中使用了NaHCO₃-CO₂缓冲系统，并采用开放式培养的方式，使细胞代谢产生的CO₂及时逸出培养器皿，再通过稳定调节培养箱中CO₂气体的浓度（5%），使之与培养基中的NaHCO₃处于平衡状态。下列化学反应方程式可说明这一系统调节pH值的原理：

NaHCO₃＋H2←↑O NaOH＋H2O＋CO₂

当CO₂浓度能够保持相对稳定时，上述反应就可达到平衡，即pH值相对恒定。

5.无毒、无污染

体外生长的细胞对微生物及一些有毒有害物质无任何抵抗力，因此培养基应无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体等）。对于天然培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水、器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。

（二）天然培养基

天然培养基主要指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立的早期，体外培养细胞都是利用天然培养基。天然培养基含有丰富的营养物质，以及各种细胞生长因子、激素类物质，渗透压、pH值等也与体内环境相似，但制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成培养基所替代。目前仍然广泛使用的天然培养基是血清（serum），另外，各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞时也不可缺少。

1.血清

（1）血清的种类。

血清可来自多种动物，目前用于组织培养的血清主要是牛血清，在培养某些特殊细胞时也用人血清、马血清等。有人曾经比较过使用猪血清培养细胞与使用牛血清培养细胞的差异，结论是差异不显著。选择牛血清作为培养用血清有以下几个方面的原因：来源充足，制备技术成熟，经过长时间的应用考察人们对其有比较深入的了解。牛血清对于绝大多数哺乳类动物细胞都是适宜的，但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物的血清更合适。

牛血清还可分为小牛血清、新生牛血清和胎牛血清。以GIBCO公司出售的牛血清为例，胎牛血清应取自剖宫产的胎牛，新生牛血清取自出生24h之内的新生牛，小牛血清取自出生10～30d的小牛。显然，胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞生长有害的成分最少。

（2）血清的成分及主要作用。

血清是由很多相对分子质量不同的生物分子组成的极为复杂的混合物，包括各种血浆蛋白质、肽类、脂肪、糖类（碳水化合物）、无机物质以及血小板凝集时释放的各种生长因子（如血小板来源的生长因子与转化生长因子β）。这些生长因子有的能促进某些细胞增殖，而有的能诱导某些细胞分化。血清中既有促进细胞生长代谢的成分，又有抑制细胞生长活动的成分，从而实现对生长调节的平衡。表1-7为胎牛血清的主要成分及含量。

表1-7　胎牛血清的主要成分及含量

血清中其他与细胞体外生长有关的基本成分见表1-8。

表1-8　血清中其他与细胞体外生长有关的基本成分

血清的主要作用如下。

①提供基本营养物质。血清中含有各种氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，这些都是细胞生长所需的基本营养物质。

②提供贴壁和扩展因子。许多体外培养的细胞必须贴附于培养器皿才能生长，帮助细胞贴壁的物质都属于细胞外基质，细胞在体内生长时具有分泌细胞外基质的功能，而在体外生长时，随着传代次数的增加这种能力逐渐下降甚至丢失。血清中含有这类物质，如纤维连接蛋白（fibronectin，FN）、层粘连蛋白（laminin，LN）等，它们可以促进细胞贴壁。

③提供激素及各种生长因子。血清中含有各种激素，如胰岛素、肾上腺皮质激素（氢化可的松、地塞米松）、类固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等，同时含有各种生长因子，如成纤维细胞生长因子（FGF）、表皮细胞生长因子（EGF）、血小板生长因子（PDGF）等。

④提供结合蛋白。结合蛋白的作用是携带重要的低相对分子质量的物质，如白蛋白携带维生素、脂肪（脂肪酸、胆固醇）以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。

⑤为培养中的细胞提供某些保护作用。有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶的成分，起到中和作用。这种作用是偶然发现的，现在则有目的地使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用，因为胰蛋白酶已广泛地应用于贴壁细胞的消化传代。血清蛋白形成了血清的黏度，可保护细胞免受机械损伤，特别是在悬浮培养搅拌时，黏度起着重要的作用。血清中还含有一些微量元素和离子，它们在代谢解毒中起重要作用，如硒等。

（3）细胞培养中使用血清的缺点。

血清的成分复杂，虽然含有许多对细胞有利的成分，但也含有一些对细胞有害的成分，使用血清有以下几个明显的缺点。

①对于体内的大多数细胞，血清不是它们接触的生理液体，它们只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清，因此使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态，血清可能促进某些细胞的生长（如成纤维细胞），同时抑制另一类细胞的生长（如表皮角质细胞）。

②血清中含有的一些物质对细胞会产生毒性作用，如多胺氧化酶，它能与来自高度繁殖细胞的多胺（如精胺、亚精胺）起反应，形成有细胞毒副作用的聚精胺。此外，补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞的生长，甚至造成细胞死亡。

③每批血清之间都有差别，其成分不能保持一致。

④在取材过程中有可能带入支原体、病毒，对培养的细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果的不可靠性。

（4）血清的质量标准。

血清质量的高低取决于两个方面的因素：一是取材对象，二是取材过程。用于制备血清的动物应健康无病并且在指定的出生天数之内，取材过程应严格按操作规程执行，制备的血清要经过严格的质量鉴定。血清质量的鉴定一般包括以下几个方面。

①理化性质，如渗透压、pH值、蛋白电泳图谱、蛋白含量、激素水平、内毒素等。蛋白含量包括血清总蛋白含量（不小于35g／L）、球蛋白含量（应小于20g／L）、血红蛋白含量等，其中球蛋白含量是一项非常重要的指标，血清中的球蛋白主要是抗体，球蛋白含量越低，血清质量越高。血红蛋白含量也是越低越好。

②微生物检测，包括对细菌、真菌、支原体、病毒等的检测，特别是对支原体、病毒的检测。支原体是一种很小的微生物，可通过孔径为0.22μm的滤膜。支原体、病毒污染在光学显微镜下难以察觉，细胞也能生长繁殖，但会影响实验结果。检测支原体的方法很多，如培养法、PCR法、荧光染色法、电镜观察法等。

③促生长效果。这是血清最重要的特性之一，应当以培养的细胞来检测，有三种方法：克隆形成率（cloning efficiency）测定法、贴瓶率（plating efficiency）测定法和连续传代培养法。克隆形成率测定一般是以悬浮生长的细胞为实验对象，如骨髓瘤细胞Sp2／0-Ag14，按有限稀释法做克隆化培养，将不同批号的血清配制成不同浓度的培养基，如10%、4%，细胞也稀释成不同浓度，如25个／mL、5个／mL，接种至96孔板，每孔200μL，培养一定时间，统计有克隆生长的孔，计算出百分比，再与作为对照的标准血清相比较，就可看出不同批号血清之间的区别。一般用比较低浓度的血清，更能观察出血清质量之间的细微差别。贴瓶率测定一般是以贴壁细胞为培养对象，培养一定时间后弃去培养基，染色后统计集落数，计算出集落数占接种细胞数的百分比，同样再与标准血清相比较，判断血清质量的高低。连续传代培养法是将细胞（如WI-28、人成纤维细胞）培养于3个一定体积的培养瓶中，如50mL培养瓶，接种数量一般是每瓶1.5×10⁵个，待测血清配制为5%的浓度，一般于第七天收集细胞，计数，取平均值，中间可更换一次培养基。连续测试三个周期以上，观察细胞的生长状况，并将每次的计数结果与标准血清的测试结果相比较。

各种血清产品在出售时都应该有质量鉴定报告，使用者可以根据自己的需要选择不同厂家、不同货号、不同批号的产品。

对于使用者来说，判断血清质量首先从外观入手。好的血清应该是透明清亮，土黄色或棕黄色，无沉淀或极少量沉淀，比较黏稠。如发现血清混浊、不透明、含许多沉淀物，说明血清已被污染或血清中的蛋白质已变性；若血清呈棕红色，说明血清中的血红蛋白含量太高，取材时有溶血现象；如果摇晃时感觉液体稀薄，说明血清中掺入的生理盐水太多。如果要进一步了解血清的质量，则应连续培养某些细胞，观察细胞的生长状况。

（5）血清的使用与储存。

正确地使用及储存血清，才能使血清发挥应有的作用。

①使用前的处理。大部分血清在使用之前必须经过灭活处理，即56℃放置30min。灭活的目的是去除血清中的补体成分，避免补体对细胞产生毒性作用。血清经过灭活也会损失一些对细胞有利的成分，如生长因子，因此也有人提出血清不经灭活直接用于培养，这样做的前提是确认血清中不含补体成分。对于一些品质高的胎牛血清和新生牛血清，可以考虑不经灭活直接用于细胞培养。

②储存条件。勿将血清置于37℃太久，若放置太久，血清会变混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到破坏而影响血清的品质。血清一般储存于-70～-20℃，同时应避免反复冻熔。购买了大包装的血清后，首先应将血清灭活处理，然后分装为小包装，如10mL、20mL、50mL，储存于-20℃，使用前熔化，由于血清结冻时体积会增加约10%，必须预留此膨胀体积的空间。熔化时最好先置于4℃。熔化后的血清在4℃不宜长时间存放，应尽快使用。

③血清解冻步骤（逐步解冻法）：由-20℃（或-70℃）至4℃冰箱解冻一天，至室温下全熔化后再分装，在解冻过程中须规则摇晃均匀（勿造成气泡），使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由-20℃至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。

④使用浓度。自从有了合成培养基之后，血清就是作为一种添加成分与合成培养基混合使用的，生长液为基本培养基加入8%～10%的血清；维持液为基本培养基加入3%～5%的血清。过多地使用血清，容易使培养中的细胞发生变化，特别是一些二倍体的无限细胞系，迅速生长之后容易发生恶性转化。

2.血浆

早期的组织培养常将组织块置于血凝块中生长，自Harrison 1970年首次使用血浆以来，曾被广泛应用。血浆不仅能提供较完备的营养，使细胞在其中能存活并缓慢生长增殖相当长的时间，而且可用来支持培养组织块。优点是为培养细胞提供具有营养的支持结构，而且铺于玻璃表面有利于细胞贴附，在换培养液和分离培养过程中起保护作用，避免培养细胞不适应和受损，此外，它还能使细胞周围形成局部集中的适应性培养液。缺点是易发生液化，目前已很少单独使用。一般使用禽类血浆，最常用的是鸡血浆，制备时选用生长1年左右的健康雄鸡，最好小于一岁。有三种采血方式：鸡翅静脉抽取、心脏取血以及颈动脉取血。采血时应防止凝血，整个制备过程要特别注意保持无菌。

鸡血浆制备的方法如下：①用干燥注射器先吸肝素少许，润湿针管内壁（注意肝素钠过量可产生细胞毒性）；②选择年幼的鸡，从鸡翅静脉处抽取血液；③在有肝素钠存在时，3000r／min离心10min，取上清液分装入若干小瓶，低温冰箱中保存备用，全过程必须无菌操作。

3.胚胎浸出液

以往培养组织的培养基中常含有一些组织浸出液，通常是胚胎浸出液。胚胎浸出液是早期动物细胞培养中应用的天然培养基，如鸡胚浸出液、牛胚浸出液等。它的主要成分为大分子核蛋白和小分子氨基酸，能促进细胞生长繁殖。近年来，由于合成培养基的不断改良和普遍应用，胚胎浸出液已逐渐被取代，仅用于满足某些特殊的需要。

以下简单介绍鸡胚浸出液的制备方法：

（1）将正常受精的鸡卵放置于37℃孵箱（或培养箱）内孵化，保持空气流通，孵箱内放盛水器以保持箱内一定的湿度，每日翻动鸡卵1或2次；

（2）经常在灯下检查鸡胚发育的状况，如发现血管不清晰等不良情况，应及时除去；

（3）将孵化了9～11d的鸡卵浸于95%酒精中10～15min，取出后置一小烧杯中，气室端朝上，气室端的蛋壳用碘酒和酒精棉球消毒；

（4）用消毒弯剪剪去气室端的蛋壳，小心剥离气囊膜和尿囊膜，用弯镊夹住鸡胚颈部，将鸡胚轻轻取出置于无菌培养皿中；

（5）去除鸡胚眼睛、血块和卵黄，用Hank′s液冲洗数次；

（6）将整个鸡胚彻底剪碎，加入等量Hank′s液，置于组织匀浆器中研磨；

（7）移入注射器中，加压将组织液挤入离心管中，密封后置于37℃培养箱中30min，待鸡胚组织中的营养成分浸出；

（8）3000r／min离心30min，取上清液，用消毒玻璃小瓶分装，封口，于-20℃冰箱低温保存，用前解冻后再2000r／min离心10min，取上清液使用，整个制备过程要保持无菌。注意小心剥离尿囊膜和鸡胚眼，后者有黑色素，会使浸出液带黑色，同时对细胞有毒性作用。

4.鼠尾胶原

胶原是细胞生长的良好基质，它能促进组织和细胞的附着，改善生长表面特性。胶原的来源有大鼠尾腱、豚鼠真皮、牛的真皮和牛眼水晶体等。实验室常用大鼠尾制胶原。鼠尾胶原为黏度较大的半透明液体，难以过滤除菌，应无菌操作制备胶原。

（1）鼠尾胶原的制备方法：

①0.1%醋酸溶液，经0.067MPa，10min高压灭菌备用；

②取250g体重大白鼠的尾一条，置于75%酒精中浸泡1h；

③将鼠尾置于培养皿中，切成1.5cm左右的小段，剥去毛皮，抽去尾腱；

④剪碎尾腱，浸泡在150mL醋酸溶液中，置于4℃冰箱内，间断振摇48h；

⑤4000r／min离心30min（最好在4℃条件下）；

⑥将上清液分装成小瓶，-20℃下保存；

⑦残渣可再加150mL醋酸溶液作用数小时后，离心，收集，保存。

（2）鼠尾胶原的使用方法：

①将鼠尾胶原均匀涂于器皿的细胞生长面，胶原量以不留液滴为度；

②培养瓶用蘸有氨水的消毒棉球消毒后置于灭菌铝盒内；

③室温下放置2h，氨气与鼠尾胶原作用，胶原凝固；

④用平衡盐溶液或基础营养液洗涤胶原表面后，再经细胞培养液浸泡过夜，37℃下干燥备用。

5.水解乳蛋白

水解乳蛋白是常用的一种天然培养基，同时也是应用较多的血清代用品。它是乳蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产物，氨基酸含量较高，可用于许多细胞系和原代细胞的培养。

购买的水解乳蛋白为淡黄色粉末，易潮解结块，但不影响其质量，可以使用。水解乳蛋白溶液呈酸性，不同商家的水解乳蛋白在细胞的营养及促生长作用方面有差异，表现在颜色、氨基酸含量和营养成分上。一般配制成0.5%水解乳蛋白溶液，呈微酸性。

配制方法：称取0.5g水解乳蛋白粉于烧杯中，用灭菌的Hank′s液数毫升将其调制成糊状，最后用Hank′s液定容至100mL，室温下放置1～2h，并搅拌数次使其完全溶解。用定性滤纸过滤，分装至玻璃瓶中，高压灭菌，4℃冰箱中保存备用。

使用方法：将0.5%水解乳蛋白溶液在37℃水浴中平衡后，在无菌条件下，取0.5%水解乳蛋白溶液与合成培养基以一定比例混合（一般为1∶1），即可用于培养。

（三）合成培养基

合成培养基是人工设计、配制的培养基。早期组织培养都是利用天然培养基，天然培养基虽然含有丰富的营养物质，能够有效地促进细胞在体外生长繁殖，但存在成分复杂、批间差异大、制备过程烦琐等局限性，使人们更迫切地希望研制出人工配制的培养基。经过许多科学工作者不懈的努力，这一愿望终于实现。目前合成培养基已经是一种标准化的商品，品种繁多，使用方便，从最初的基本培养基发展到无血清培养基、无蛋白培养基，并且还在不断地发展、完善以满足更多的需求。合成培养基的出现极大地促进了组织培养技术的普及和发展。

1.基本培养基

最初研制合成培养基，就希望使其完全替代天然培养基，但结果没能像人们所预期的那样，许多合成培养基都只能使体外培养细胞短暂生存，只有在添加了少量天然培养基（血清）之后，细胞才能在其中长期生长繁殖。在研制的过程中人们还发现，原来只针对某一种细胞研制的培养基也适合于许多其他细胞，这类合成培养基可称为基本培养基或通用培养基，在添加了一定比例的血清之后，称为完全培养基。基本培养基是目前使用最多的合成培养基。

（1）基本组分。

研制合成培养基，主要是通过分析天然培养基的成分及了解细胞代谢的基本过程，依照蛋白质代谢、核酸代谢、糖类代谢、脂类代谢的基本规律设计培养基的成分。最初研制的培养基所含成分十分复杂，如199培养基共含有60多种成分。这些培养基虽然成分复杂，但仍然不能完全替代天然培养基。后来人们认识到既然必须添加少量血清，就可以适当减少合成培养基的一些基本组分，经过试验筛选，研制出了成分最简单的培养基——低限量基础培养基（minimum essential media，MEM），它含有20多种物质，这些物质就是培养基必不可少的基本组分。基本组分包括四大类物质，即无机盐、氨基酸、维生素、糖类。

无机盐：CaCl₂、KCl、MgSO₄、NaHCO₃、NaH₂PO₄。

氨基酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸（均为L型）。

维生素：偏多酸钙、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醛、核黄素、硫胺素。

糖类：葡萄糖。

除了上述与细胞生长有关的物质以外，培养基中一般还要加入酚红（一种pH指示剂）。

MEM并不是常用的基本培养基，常用的基本培养基都含有30多种成分，如RPMI-1640，一般是增加了一些非必需氨基酸和维生素，如丝氨酸、脯氨酸、生物素、维生素B₁₂等。

部分基本培养基的基本组分——无机盐类、氨基酸类、维生素类和其他化合物分别见表1-9、表1-10、表1-11和表1-12。

表1-9　部分基本培养基的基本组分——无机盐类（单位：mg／L）

续表

表1-10　部分基本培养基的基本组分——氨基酸类（单位：mg／L）

续表

表1-11　部分基本培养基的基本组分——维生素类（单位：mg／L）

表1-12　部分基本培养基的基本组分——其他化合物（单位：mg／L）

（2）种类。

目前基本培养基的种类已达数十种，其中常见的有以下几种。

①MEM。前已述及，也称为低限量Eagle培养基，它仅含有12种必需氨基酸、8种维生素及必要的无机盐，成分简单。由于成分简单，易于添加某种特殊成分以适应某些特殊细胞的培养。

②DMEM（Dulbecco’s modified Eagle medium）。DMEM是由Dulbecco等人在MEM培养基的基础上研制而成。与MEM相比，主要是增加了各成分的用量，分为高糖型和低糖型，高糖型的葡萄糖含量为4500mg／L，低糖型的葡萄糖含量为1000mg／L。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适合于生长较快、附着较困难的肿瘤细胞。

③IMDM（Iscove’s modified Dulbecco’s medium）。IMDM是Iscove等人对DMEM培养基改良的结果。它含有42种成分，与DMEM相比，增加了许多非必需氨基酸及一些维生素，还增加了HEPES，葡萄糖含量为高糖型。IMDM适合于细胞密度较低、细胞生长较困难的情况，如细胞融合之后杂交细胞的筛选培养、DNA转染后转化细胞的筛选培养。

④RPMI-1640。RPMI-1640是由Moore等人研究成功的，最初是为培养小鼠白血病细胞而设计。开始的配方特别适合于悬浮细胞生长，主要针对淋巴细胞，后经几次改良，从RPMI-1630、RPMI-1634，直至RPMI-1640。其组分较为简单，适合于许多种类细胞的生长，如肿瘤细胞或正常细胞、原代培养或传代培养的细胞。RPMI-1640是目前应用最为广泛的培养基之一。

⑤199培养基、109培养基。199培养基是Morgan等人在1950年研制成功的，是最早出现的培养基之一，当时是为培养鸡胚组织而设计的。199培养基的成分有60多种，几乎含所有氨基酸、维生素、生长激素、核酸衍生物等。109培养基是199培养基的改良之作，比199培养基的效果更好。

⑥F10、F12。1962年，Ham针对小鼠二倍体细胞克隆化培养设计了F7培养基，在此基础上进行改良成为F10培养基，使之不仅适合于小鼠二倍体细胞的培养，也适合于人类二倍体细胞的培养。Ham在1963年又研制成F12培养基，这种培养基的特点是在配方中加入了一些微量元素和无机离子，可以在加入很少血清的情况下应用，特别适合于进行单细胞分离培养。F12培养基也是无血清培养基中常用的基础培养基。

⑦McCoy′s5A。McCoy′s5A培养基是McCoy T.A.等人在1959年研制成功的，是一种专门为肉瘤细胞设计的培养液，后来发现它特别适合于原代细胞培养，适合于较困难的细胞的生长。

上述培养基都已商品化，并且同一种培养基还有不同形式的产品，干粉的或液体状的，大包装的或小包装的。液体的还分为10倍浓缩液、2倍浓缩液及工作液等。有些培养基不含酚红，有些不含钙离子、镁离子，使用者可以根据实验需要选择产品。

2.无血清培养基

无血清培养基即不需要添加血清就可维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。

虽然由基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养实验的要求，但对有些实验不适合。如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用，而血清中可能含有各种生长因子；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力，或者要大规模地培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。因此，研制一种无血清培养基一直是生物科学工作者努力追求的目标。

（1）无血清培养基的设计思路。

设计无血清培养基，一定要了解所培养的细胞是正常有限细胞系，还是永生不死或转化的细胞；是来自上皮组织或结缔组织，还是肌肉组织等。同时要了解培养这种细胞的目的，是要保持其不分化状态或向一定方向分化，还是希望得到其分泌产物等。与基础培养基不同，无血清培养基的针对性很强，一种无血清培养基一般只适合于一种细胞的培养。

在无血清培养基的研制过程中，有以下几种策略。

①分析血清的成分。对细胞生存、生长所需的每一种血清成分进行分离鉴定，这是一项繁重的工作，最后证明是失败的。因为许多激素、生长因子需协同作用并且在血清中含量极少。还有许多人们还不了解的成分，根本无法用常规的生化方法分离提纯。

②采用合成的方法。即在现有基础培养基中添加不同组合的各种生长因子（根据不同细胞的特点）、激素、结合蛋白质以及贴壁和扩展因子以替代血清。

③寻找限制因素。Ham等人在研制无血清培养基时，首先将现有培养基进行新的处方设计，然后降低血清浓度，直到细胞生长受限制，再调整培养基中的每种成分的浓度（维生素、氨基酸、激素、生长因子等），直到细胞恢复生长。

（2）无血清培养基的基本配方。

无血清培养基分为基础培养液和添加组分两大部分。基础培养液以F12和DMEM最为常用，一般两者以1∶1混合。添加组分包括以下几大类物质。

①促贴壁物质。许多细胞必须贴附于瓶壁才能生长，这种情况下在无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般是细胞外基质，如纤维连接蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化起着重要的作用。纤维连接蛋白主要促进来自于中胚层的细胞的贴壁和分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。而层粘连蛋白主要促进内皮细胞以及来自于内胚层的细胞的贴壁和分化，如表皮细胞、支气管上皮细胞、分泌型上皮细胞、神经细胞和肝细胞等。

②生长因子及激素。针对不同的细胞添加不同的生长因子，如培养角质细胞加表皮生长因子（EGF），培养神经细胞加神经生长因子（NGF），培养内皮细胞加内皮细胞生长因子（ECGF）等。当然有些生长因子可以刺激多种细胞的生长，表1-13总结了部分生长因子的使用情况。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质。有些激素对于许多细胞是必不可少的，如胰岛素。还有一些激素对特定的细胞有重要的作用，如泌乳素对乳腺上皮细胞。

表1-13　部分生长因子的使用情况

③酶抑制剂。培养贴壁生长的细胞，需要用胰蛋白酶消化传代，在无血清培养基中必须含有酶抑制剂，以终止胰蛋白酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰蛋白酶抑制剂。

（3）无血清培养基的使用方法。

细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度，从10%减少至5%、3%、1%，直至无血清培养。在逐步降低血清浓度的过程中，要注意观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活的细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验或生产完成之后，这些细胞一般不再保留，很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞在转入无血清培养基培养之前，应留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。

（4）无血清培养基的应用。

无血清培养基被广泛应用于培养哺乳动物细胞和无脊椎动物细胞以制备单克隆抗体、病毒抗原和重组蛋白等。大多数无血清产品含有向细胞内转运离子的转铁蛋白和调节葡萄糖摄取量的胰岛素，以及一些蛋白质如清蛋白、纤维连接蛋白、胎球蛋白等，这些蛋白在细胞培养中发挥各自不同的功能，如吸附毒性化合物、抗生物反应器剪切力、提供细胞贴壁所需的基质、作为脂类和其他生长因子的载体等。

表1-14列出了近几年开发的无血清培养基及无蛋白培养基。

表1-14　近几年开发的无血清培养基及无蛋白培养基

续表

3.无蛋白培养基和限定化学成分培养基

无蛋白培养基（protein free medium，PFM）即不含动物蛋白质的培养基。大部分无血清培养基中仍含有较多的动物蛋白质，如胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白等。从生物技术发展的趋势看，不含动物蛋白质的培养基有广阔的应用前景，许多利用基因工程技术重组的蛋白质最终要应用于人体，如果在生产过程中使用了含有动物蛋白质的培养基，纯化过程就比较复杂，最终要达到一定的质量标准也有一定的难度。PFM就是为了适应这一发展趋势而出现的，许多PFM中添加了植物水解物以起到动物激素、生长因子的作用。目前已经有适合于CHO细胞生长的PFM，如GIBCO公司生产的CHO-ⅢA PFM。

限定化学成分培养基（chemical defined medium，CDM）是指培养基中的所有成分都是明确的，它同样不含动物蛋白质，同时也不添加植物水解物，而是使用一些已知结构与功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。这种培养基更有利于分析细胞的分泌产物。目前已经有适合于293细胞、CHO细胞、杂交瘤细胞生长的CDM问世。

三、杂用液

1.消化液

取材进行原代培养时常常需要将组织块消化解离形成细胞悬液，传代培养时也需要将贴壁的细胞从瓶壁上消化下来，常用的消化液有胰蛋白酶溶液和EDTA溶液，有时也用胶原酶（collagenase）溶液。

（1）胰蛋白酶溶液。

胰蛋白酶是目前应用最为广泛的组织消化分离试剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水解作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽链，使细胞间质中的蛋白质水解，从而使细胞分散开。

（2）EDTA溶液。EDTA是一种化学螯合剂，对细胞有一定的解离作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便。常用工作液浓度为0.02%。EDTA的作用较胰蛋白酶的作用缓和，适用于消化、分离传代细胞，但EDTA单独使用时不能使细胞完全分散，一般与胰蛋白酶配成1∶1的混合液来消化细胞，配制时应加碱助溶，配制后可过滤除菌，也可高温、高压消毒灭菌。

（3）胶原酶溶液。胶原酶溶液在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶溶液作用的对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。胶原酶溶液的使用浓度为0.1～0.3 mg／L或200000U／L，作用的最佳pH值为6.5。胶原酶不受Ca^2＋、Mg^2＋及血清的抑制，配制时可用PBS。

2.pH调整液

常用的有NaHCO₃溶液和HEPES液。

（1）NaHCO₃溶液。NaHCO₃是培养基中必须添加的成分，一般情况下按照说明书的要求准确添加，以保证培养基在5%CO₂的环境下pH值达到设计标准。如果细胞培养是封闭式，即不与5%CO₂的环境发生交换，所使用的培养基就不能按说明书的要求加入NaHCO₃。常用5.6%或7.4%的NaHCO₃溶液调节培养基，使之达到所要求的pH环境。

（2）HEPES液。HEPES是一种弱酸，中文名称是羟乙基哌嗪乙烷磺酸。英文名称是N-2-hydroxyethylpiperazine-N′-ethanesulfonic acid。HEPES对细胞无毒性，主要作用是防止培养基pH值迅速变动。在开放式培养的情况下，观察细胞时培养基脱离了5%CO₂的环境，CO₂气体迅速逸出，pH值迅速升高，若加了HEPES液，此时可维持pH值在7.0左右。在进行克隆化培养时一般要添加HEPES液。有些培养基已含有HEPES，如IMDM，这类培养基呈橘红色，细胞生长过程中培养基的颜色变化不大，因此更要注意观察细胞，防止细胞密度太大。HEPES也可配制成添加试剂，一般配成100倍浓缩液，使用的终浓度为0.01～0.05mol／L。

3.谷氨酰胺补充液

谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，在合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺容易降解，所以都是在使用前添加。谷氨酰胺使用终浓度为0.002mol／L。一般配制为100倍浓缩液，配制时应加温至30℃，完全溶解后过滤除菌，分装至小瓶，储存于-20℃。

4.抗生素液

常用的是青链霉素（penicillin-streptomycin solution），俗称双抗溶液（double antibody solution）。青霉素主要对革兰氏阳性菌有效，链霉素主要对革兰氏阴性菌有效，加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌的污染。在细胞培养液中青霉素的工作浓度（推荐值）为100U／mL，链霉素的工作浓度（推荐值）为0.1mg／mL。一般配制成100倍浓缩液，可用PBS或培养基配制。一个包装即100mL青链霉素（100×）可以配制10L细胞培养液。

除了青链霉素以外，还有一些抗生素可用于组织培养。表1-15总结了各种抗生素的使用情况。

表1-15　各种抗生素的使用情况

知识拓展

培养基的选用

选择培养基没有一定标准，有几点建议可供参考：建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基，可以查阅文献，或在购买细胞株时咨询；根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基，如小鼠细胞株多选1640；进行细胞杂交、基因转移实验，可选择IMDM；用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较烦琐；通常培养基可以适合多种细胞，细胞也可以在不同培养基中生长，例如，在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或199培养基中同样很容易生长；培养基养分不同会导致细胞生长效果不同、病毒或蛋白表达不同，应该选择效果最好的培养基，考虑生物制品的综合成本；最终目的是追求生物制品的得率，得率高则成本低。

现在基本培养基都已商品化，如果小量培养可以购买商品化的成品，但如果是大规模培养，从成本考虑一般是根据细胞类型进行配制。另外在进行细胞培养时，通常要在基础培养基中添加血清，但在某些特殊实验中血清成分会影响实验结果，还存在血清成分的不确定性、不同批次的不稳定性、成本等问题。现在无血清培养基在细胞培养中所占的份额越来越大，研究无血清培养基的配制也是细胞规模化培养的需要。

GIBCO公司推出专门用于冷冻保存的细胞培养基

Invitrogen旗下的GIBCO公司最近推出了专门为冷冻保存细胞而制的哺乳细胞培养基——Recovery^TM细胞冷冻保存培养基（Recovery^TM Cell Culture Freezing Medium）。此培养基采用了优化的配方，可提高细胞的存活率，让细胞在溶解后更容易恢复；不需要加入其他成分，可以直接使用；可以用于更多的哺乳动物株系。Recovery^TM细胞冷冻保存培养基是在细胞冷冻保存培养基的基础上优化了胎牛血清和牛血清之间的比例而制成的。

Millipore公司独家推出表皮角质形成细胞的3D培养基

2008年10月21日，Millipore公司宣布独家推出表皮角质形成细胞的3D培养基。该培养基由CELLnTEC公司（CELLnTEC Advanced Cell Systems）研发，Millipore公司共同拥有并出售。

过去，3D表皮体外模型的制备主要是由商业化的公司提供，它们提供的3D表皮模型一旦送达，必须立刻使用。有些实验室想自己制备模型，但碍于流程太复杂，且缺乏3D表皮模型特定的培养基。利用CELLnTEC公司开发的3D优化的培养基，再加上CELLnTEC原代人角质形成细胞和Millipore公司的Millicell inserts，就能在实验室中自己建立3D表皮模型，成本也不高。另外，该系统使用的是完全限定的培养基，让研究人员能完全掌控实验状况和时机，而价格也相当有吸引力。大量研究显示，新鲜制备的原代细胞比细胞系更能准确地模拟体内环境，而且3D细胞培养又比2D细胞培养更能体现体内的环境。因此，用原代细胞构建的3D培养是模拟体内复杂生物过程的最准确方法。

思考题

1.简述培养基的基本要求。

2.血清在细胞培养中的主要作用是什么？

3.细胞培养中使用血清的缺点有哪些？

4.试述配制人工合成培养基的注意事项。

5.细胞培养基偶然被冻，能否继续使用？

6.培养基中添加了血清和抗生素后，可长期保存吗？

7.培养基及其他添加物和试剂可反复冻熔吗？

8.保存血清最好的方法是什么？

9.为什么要热灭活血清？

10.液体培养基的保存是冷藏好，还是冷冻好？