蛋白凝胶脱色缓冲液配制

12．3．1　实验方法

12．3．1．1　仪器及试剂的配制

（1）仪器。①高速冷冻离心机，②电泳仪，③电泳槽（垂直板），④40W日光灯具一套（3支日光灯并列组装在一个平面上）。

（2）试剂配制。

①5×10^－2mol/L、pH为7．8的PBS缓冲液（用于酶液的提取）。

A液：NaH₂PO₄1．56g，用蒸馏水定容至200mL。

B液：NaH₂PO₄·12H₂O 17．907g，用蒸馏水定容至1　000mL。

取A液85mL，B液915mL混合即得5×10^－2mol/L pH为7．8的PBS缓冲液。

②凝胶母液的配制。

A液：1mol/L HCl 48mL，三羟甲基氨基丙烷（tris－hydroxymethyl－aminomethane，Tris）36g，四甲基乙二胺（tetramethyl ethylene diamine，TEMED）0．24mL，最后用蒸馏水定容至100mL，pH为8．9。

B液：取丙烯酰胺30g，溶于50mL蒸馏水后，再加甲叉双丙烯酰胺0．8g，溶解后再用蒸馏水定容至100mL。

C液：核黄素4mg用蒸馏水定容至100mL。

D液：1mol/L HCl 48mL，加Tris 5．9g，TEMED 0．46mL，用蒸馏水定容至100mL，pH为6．7。

E液：丙烯酰胺10g，溶于50mL H₂O中，加甲叉双丙烯酰胺2．5g，溶解后用蒸馏水定容至100mL。

F液：蔗糖40g，用蒸馏水溶解定容至100mL。

③电极缓冲液

称取Tris 6g，甘氨酸28．8g，同溶于水中定容至100mL，pH为8．3，用时稀释10倍。以上溶液均于棕色瓶中，于4℃保存。

④SOD同工酶染色液的配制

A液：2．45×10^－3mol/L NBT。取NBT 0．4g加水溶解定容至200mL。

B液：含2．8×10^－5mol/L核黄素、2．8×10^－2mol/L TEMED的5×10^－2mol/L PBS缓冲液，pH为7．8。取21mg核黄素，TEMED 0．838mL，用3．6×10^－2mol/L、pH为7．8的PBS缓冲液溶解定容至200mL。

C液：内含1×10^－4mol/L EDTA的5×10^－2mol/L、pH为7．8的PBS缓冲液。取乙二胺四乙酸（edetic acid，EDTA）5．845mg溶于200mL 5×10^－2mol/L、pH为7．8的PBS缓冲液。

12．3．1．2　方法

按照以下配方配制电泳凝胶。

（1）分离胶的配制：取凝胶母液按A∶B∶C∶水＝1∶3∶1∶3（体积比）配制，两块胶片需70mL（T＝10%）。

（2）浓缩胶的配制：取凝胶母液按D∶E∶C∶F＝1∶3∶1∶3（体积比）配制，两块胶片需20mL。

（3）灌胶：按常规方法进行。

（4）点样与电泳：控制电流，浓缩胶为15mA，分离胶为20mA，10℃下约5h完成电泳（点样量不能超过250μg蛋白质，否则凝胶上一片透明，看不清条带）。

（5）SOD同工酶的染色：电泳结束后，依次浸入下列染色液中：①在A液中于黑暗下浸20min；②在B液中于黑暗下浸15min；③在C液中浸泡并于40W×3支日光灯下光照30min。

经上述染色后，在蓝色的胶片中会出现清晰透明的SOD同工酶谱带，染色后的胶片经自来水冲洗掉浮色后，在蒸馏水中保存数日，谱带不消失。

Cu，Zn－SOD对KCN敏感，Fe－SOD对H₂O₂敏感，Mn－SOD对两者均不敏感，分别于染色液中加入5mmol/L KCN和5mmol/L H₂O₂进行同工酶类型鉴定。