培养用液与培养基的配制

项目四　培养用液与培养基的配制

一、项目背景

培养用液是维持组织细胞生存、生长及进行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶液，主要包括平衡盐溶液、培养基、杂用液（其他培养用液）三大类。平衡盐溶液具有维持渗透压，调控酸、碱平衡的作用，并可提供细胞生存所需的能量和无机离子成分，另外可用做洗涤组织、细胞以及配制各种培养用液的基础溶液，常用的平衡盐溶液有PBS、Earle、Hank′s、D-Hank′s等。培养基可分为天然培养基和合成培养基。天然培养基主要来自动物体液或从组织中分离提取的成分，其营养性高，成分复杂，但来源受限，而且存在较大的个体差异；合成培养基是模拟人或动物体内环境合成的，配方恒定，常规做法是将合成培养基中混入少量天然成分，使细胞良好生长和繁殖。杂用液包括消化液、pH值调整液、谷氨酰胺补充液、抗生素液等。

二、项目目标

（1）掌握PBS、DMEM培养基及胰蛋白酶的配制方法及注意事项；

（2）培养学生的实验设计能力和团结协作精神。

三、工作流程

流程一：工作准备

流程二：操作方法

（1）PBS储存液（10×）：NaCl 8.0g、KCl 0.2g、KH2PO₄0.2g、Na₂HPO₄·12H2O 3.49g（或Na₂HPO₄·2H2O 1.56g），溶于100mL双蒸水中。

PBS应用液：取储存液100mL，用三蒸水稀释至1000mL即成，经103.5kPa（121℃）30min灭菌，室温或4℃下保存，备用。

（2）0.1%胰蛋白酶：称取1g胰蛋白酶，溶解于1L已灭菌的PBS中，用磁力搅拌器搅拌助溶，在超净工作台中过滤、分装，每人10mL。

（3）DMEM培养基：

①取700～800mL三蒸水，加入磁棒；

②将粉状培养基加入其中，清洗袋子内壁2～3次，用磁力搅拌器搅拌30min；

③将NaHCO₃溶解到烧杯中（浓度为5.6%），防止局部过浓，调整溶液的pH值至7.1～7.2，加三蒸水定容至1000mL；

④用正压式不锈钢滤器过滤，前20mL弃去，分装使用。

流程三：物品的清洗与归位、实验室的整理等

实验结束后，应将实验用器材根据情况进行清洗、整理归位、摆放整齐，打扫实验场地的卫生。

四、工作注意事项

（1）使用新制备的三蒸水，严格无菌操作；

（2）保证培养液中各成分完全溶解（判断方法：将培养液置于室温或4℃冰箱中30 min后，观察瓶底有无颗粒产生）；

（3）由于在高压灭菌后pH值会降低0.1～0.2，过滤除菌后会升高0.1～0.2，所以pH值要根据实际情况调整。

五、思考题

（1）简述DMEM培养基的配制流程及注意事项。

（2）简述血清在细胞培养中的主要作用。

（3）简述细胞培养中使用血清的缺点。