细胞培养用液的制备

细胞培养用液是维护细胞在体外生存、生长以及在细胞培养操作过程中所需的基本溶液。培养用液主要有三大类：平衡盐溶液（balanced　salt　solution，BBS）、培养基（天然和合成培养基）及其他常用液。

一、配制常用液的要求

1．使用高度纯化的三蒸水。

2．按照用液的配方计算所需各成分的用量，然后准确量取，并按规定顺序溶于三蒸水。

3．保证各组分完全溶解，进行pH值测试和调整。

4．消毒分装小瓶，抽样做无菌实验，保证用液无菌。

二、平衡盐溶液的配制

BBS是在生理盐水基础上发展起来的。它是人工合成培养基的基础用液，常用来洗涤组织细胞。其主要成分是无机盐和葡萄糖，具有维持细胞渗透压、调节酸碱平衡，为细胞生存提供所需能量和无机离子等作用。BBS液中少量酚红作为溶液酸碱度变化的指示剂，溶液变酸时呈黄色，溶液弱碱性（pH7．2～7．4）时呈深红色，pH值上升到7．6以上是为紫红色。在碳酸盐缓冲系统中，NaHCO3具有调节CO2浓度的作用。

最常用的BBS是Hanks液，磷酸盐缓冲液（phosphate－buffered　saline，PBS）和DHanks液等。其配制方法如下。

1．Hanks液　为了便于保存和减少有关成分化学反应，常配成浓缩液。

（1）浓缩母液配制（10×）

甲液：取400ml三蒸水依次溶解下列试剂：NaCl　80g，KCl　4g，MgSO4·7H2O　2g，CaCl21．4g（CaCl2·2H2O　1．85g），待完全溶解后，补足三蒸水至500ml，高压或滤过灭菌，小瓶分装，4℃保存。

乙液：取450ml三蒸水依次溶解下列试剂：Na2HPO40．6g（Na2HPO4·12H2O 1．52g），KH2PO40．6g，葡萄糖10g，补足三蒸水至500ml，高压或滤过灭菌，分装，4℃保存。

（2）工作液配制（1×）：取上述甲、乙液各50ml混匀，用三蒸水稀释至800ml；将0．35g　NaHCO3溶解在37℃100ml三蒸水中；用数滴NaHCO3液溶解0．02g酚红；将NaHCO3液及酚红液加入上述800ml甲、乙混合液中，用三蒸水定容至1　000ml，充分混匀，4℃冰箱过夜；滤过灭菌，分装，4℃保存。

2．PBS液　可配成含0．85%NaCl，pH7．2的PBS（简称pH7．2PBS）。

（1）PBS储存液（10×）配制：NaCl　8．5g，KCl　0．2g，Na2HPO4·12H2O　2．85g（或Na2HPO4·2H2O　1．13g），KH2PO40．27g，溶于100ml三蒸水中，高压或滤过灭菌，4℃保存。

（2）PBS工作液（1×）配制：取储存液50 ml加三蒸水450ml，高压或滤过灭菌，4℃保存。

3．D－Hanks液　为无Ca2＋、Mg2＋的Hanks液，可用于配制消化液和洗涤细胞用液。配制方法为：NaCl　8g，KCl　0．4g，Na2 HPO4·2H2O　0．06g，KH2PO40．06g，NaHCO30．35g，酚红0．02g。以上成分依次溶于500ml三蒸水中，完全溶解后，补足三蒸水至1　000ml。

4．注意事项

（1）BBS液中各试剂规格为优级纯或分析纯试剂。

（2）配制后Hanks与D－Hanks液呈桃红色，pH7．4左右，没有浑浊和沉淀。

（3）Ca2＋、Mg2＋是细胞膜的重要组分，有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用为无Ca2＋、Mg2＋的D－Hanks液或PBS液配制。

（4）酚红对细胞有一定的毒性，目前实验中的用量除0．01g外，还有0．02g和0．005g。

三、培养基的配制

1．血清的灭活处理　血清是常用的天然培养基，使用之前需经灭活处理，其步骤如下：

（1）选用与血清瓶同规格的对照瓶一个，在对照瓶内放入与血清等体积的水。

（2）对照瓶内插入温度计并放入水浴箱中，接通电源，调节温度控制钮，使温度计所示温度保持在56℃。

（3）血清瓶与对照瓶在室温平衡一段时间后，一齐放入水浴箱中，待温度计所示温度上升到56℃时，定时30min。

（4）大瓶血清灭活后，进行分装，并抽样做无菌实验，－70～－20℃保存。

2．合成培养基的配制方法　现在广泛使用的合成培养基是干粉型培养基，国外许多厂家有成型产品，如Life　Technology公司及Hyclone公司的RPM1640、DMEM等。这类产品性质稳定，便于储存和运输。使用时按照说明书指示配制，但配制方法基本相同，一定要确保培养基所有组分完全溶解，并在灭菌和保存过程中不产生沉淀，以RPMI－1640为例，其步骤如下：

（1）取一袋干粉培养基（配1　000ml量）或按说明书准确称取10．4g干粉培养基，并称取3．0g羟乙基哌嗪乙磺酸（hydroxyethyl piperazine　ethanesulfonic　acid，HEPES），一起加入700ml三蒸水中，磁力搅拌至颗粒完全溶解（3～4h，橙黄色）。

（2）称取2．0～2．2g　NaHCO3溶于30ml三蒸水中，37℃30min至颗粒溶解。

（3）上述两液混合，加入至终体积1　000ml，在4℃静止2～3h。滤过除菌，分装，抽样做无菌实验，－20℃保存。

3．血清细胞培养基（完全培养基）的配制　取80～90ml合成培养基、10～20ml灭活的血清，加入青霉素、链霉素至终浓度各为100U／ml即可。

4．注意事项

（1）用3d内玻璃蒸馏器制备的三蒸水配制培养液。

（2）培养液中各成分是否完全溶解的判断方法：将培养基置室温30min后观察瓶底有无颗粒产生。

（3）按2周用量配制为宜，配量过多，存放时间过长会造成培养基老化、变质产生沉淀。

（4）正常体细胞宜使用20%血清培养液，细胞株（系）宜使用10%血清培养液。

四、其他常用液

其他常用液主要有：用来分散细胞，制备细胞悬液的消化液；调整各种培养用液酸碱度的pH调整液；防止培养过程中发生污染的抗生素等。

1．消化液　最常用的是0．25%的胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠（ethylenediami－netetra－aceticacid，EDTA），它们可以单独使用，也可以按一定比例混合使用。

（1）0．25%胰蛋白酶：胰蛋白酶粉0．25g，加D－Hanks液100ml，室温和4℃间断磁力搅拌2d，但室温如高于20℃时要减少酶液在室温中的搅拌时间，溶解后的酶液滤过除菌，分装，－20℃保存。

（2）0．02%EDTA液：EDTA　0．2g，加入D－Hanks液1　000ml，可高压蒸汽灭菌，用前调整pH到7．4，4℃冰箱保存。

2．pH调整液

（1）NaHCO3溶液：常用的浓度有7．4%、5．6%、3．7%三种，配制时用37℃三蒸水溶解后通过滤膜除菌，分装后4℃保存。使用时，NaHCO3液要逐滴加入，并不时搅动培养液，以防pH值过高。

（2）1mol／L　HCl：37%HCl　8．4ml，加三蒸水至100ml，过滤除菌，密封后4℃保存。

（3）HEPES液：HEPES是一种非离子缓冲剂，它可以长时间保持较强的缓冲作用，维持恒定的pH值。20mmol／L的浓度对细胞无毒性，多数细胞都能使用。

（4）抗生素液：在培养液中加入适量抗生素，可预防操作不慎产生的污染。常用的有青霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素等。他们的使用浓度为青霉素100U／ml、链霉素100U／ml、卡那霉素50μg／ml、庆大霉素50～100U／ml。可将抗生素溶于三蒸水中，配成100×或200×储存液，分装于青霉素小储瓶中，－20℃保存，配液时加入。