细菌悬液制备程序

1．细菌繁殖体悬液的制备

（1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5．0～10．0ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18～24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养18～24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37℃培养18～24h，即为第3代培养物。

（2）取菌种第3～14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（18～24h），用5．0ml吸管吸取3．0～5．0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5．0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合（振荡）20s，或在手掌上振敲80次，以使细菌悬浮均匀。

（3）初步制成的菌悬液，先用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度，然后以稀释液稀释至所需使用的浓度。

（4）细菌繁殖体悬液应保存在4℃冰箱内备用。应当天使用不得过夜。

（5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。

2．细菌芽胞悬液的制备

（1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管吸加适量营养肉汤培养基，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5～10ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18～24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养18～24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养肉汤培养基，于37℃培养18～24h，即为第3代培养物。

（2）用10．0ml吸管吸取5．0～10．0ml第3～5代的18～24h营养肉汤培养物，接种于罗氏瓶中营养琼脂培养基表面，将其摇动使菌液布满营养琼脂培养基的表面，再将多余肉汤培养物吸出，将罗氏瓶置于37℃温箱内，培养5～7d。

（3）用接种环取菌样少许涂于玻片上，固定后以改良芽胞染色法染色，并在显微镜（油镜）下进行镜检。当芽胞形成率达95%以上时，即可进行以下处理。否则，应继续在室温下放置一定时间，直至达到上述芽胞形成率后再进行以下处理。

改良芽胞染色法：①用接种环取菌样涂布于玻片上，待自然干燥。而后通过火焰加热将菌固定于玻片上。②将涂片放入平皿内，片上放两层滤纸，滴加足量的5．0%孔雀绿水溶液。将平皿盖好，放54～56℃条件下，加热30min。取出，去滤纸，用自来水冲洗残留孔雀绿溶液。③加0．5%沙黄水溶液，染1min。水洗，待干后镜检。芽胞呈绿色，菌体呈红色。

（4）罗氏瓶培养物，用10．0ml吸管加10．0ml无菌蒸馏水于每个罗氏瓶中，以L棒轻轻推刮下菌苔。吸出第1批洗下的菌悬液，再向瓶内吸加5．0ml无菌蒸馏水，重复洗菌1遍。将第1批和之后洗下的菌悬液集中于一个含玻璃珠的无菌三角烧瓶中，振摇5min，打碎菌块，使成均匀的芽胞悬液。

（5）必要时，将盛装菌悬液的三角烧瓶置45℃水浴中24h，使菌自溶断链，分散成单个芽胞。

（6）用无菌棉花或纱布过滤芽胞悬液，清除其中的琼脂凝块。

（7）将过滤后的芽胞悬液，置无菌离心管内，以3 000r/min速度离心30min。弃上清液，加蒸馏水吹吸使芽胞重新悬浮。再离心和重新悬浮清洗，先后共3遍。

（8）将洗净的芽胞悬浮于三角烧瓶内蒸馏水中，并加入适量小玻璃珠。

（9）将芽胞液放于80℃水浴中10min（或60℃，30min），以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后，保存于4℃冰箱中备用。有效使用期为半年。

（10）芽胞悬液在使用时，应先进行活菌培养计数。

（11）怀疑有杂菌污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。