鱼用疫苗制备方法

四、鱼用疫苗制备方法

所谓鱼用疫苗，是用致病微生物制成的，可用于接种以预防鱼病的生物制品。用细菌制成的生物制品称为细菌疫苗；用病毒制成的生物制品称为病毒疫苗。若按制备的方法来分，可分为天然疫苗和人工疫苗两种。前者是从天然病鱼或人工感染的病鱼内脏（肝、胰、肾）中制成的，又称组织苗或脏器苗。后者是以人工培育、增殖病原体的方法制备的。若按病原体的活力来分，可分活苗和死苗两种。活苗是选用病原体弱毒株，经过多次传代或其他方法处理后，使病原体还能在鱼体上生活，但其毒力已大大降低或全部丧失，鱼体感染后不再致病，这种疫苗又称减毒活疫苗。死苗是把病原体用化学药物或热灭活处理，使病原体失去活性制成的疫苗，又称灭活疫苗。

为了制好鱼用疫苗，首先要了解鱼类人工免疫的原理。给鱼类注射或口喂菌苗、疫苗或类毒素，使其获得抵抗某种疾病的能力，称为鱼类人工免疫。

引起疾病的细菌、病毒等病原体，被称为“抗原”，各种不同的抗原进入鱼体后，可产生不同的“抗体”。抗体是一种球蛋白，具有解除病原微生物及其产物（指病毒）的作用，并可与抗原结合产生特异性反应。抗体有两种，一种是特异性的，另一种为非特异性的。免疫就是抗原与抗体这一对矛盾体相互作用的结果。有的传染病鱼得过之后不会再得，就是因为那种具有特异性的抗体一旦形成可长期存在的缘故。

鱼用疫苗的制备过程，多数采取人用和兽用疫苗的生产方法。病毒疫苗和细菌疫苗的制备方法大致相同。

1．抗原的制备 抗原是疫苗制备的物质基础。病毒抗原可以通过组织培养或鱼体培养来获得。细菌抗原可以通过人工培养基分离培养。下面详细介绍细菌疫苗的制备方法。

（1）鱼体病变部位的检查。检查必须选用刚死不久的病鱼，用肉眼和显微镜仔细检查各组织器官和病变部位，采取无菌操作手段，动作要迅速，尽量避免污染。如是外表疾病，可取黏液、溃疡、脓肿等病灶材料进行检查；如是败血病，可以采用鱼的肾脏作切片染色检查，判断病原菌的类别。要记录病鱼的来源、体长、体重、年龄、症状、取材部位和日期。

（2）病原菌的分离培养。常用的分离培养基有鱼肉汤蛋白胨和黏细菌两种。鱼肉汤蛋白胨培养基是用胰蛋白胨1%，食盐0．5%，磷酸氢二钾0．2%，酵母膏1%，鱼肉汤（鱼肉︰水＝1︰1）100毫升，琼脂2%，混合配合。黏细菌培养基是用胰蛋白胨0．05%，酵母膏0．05%，醋酸钠0．02%，琼脂2%，牛肉膏0．02%，混合配合。不论采用哪种培养基，一定要把pH控制在7．2～7．4。配好后采取高压灭菌（0．15兆帕，30分钟）备用。如需提高黏细菌培养基的纯度，可再增加0．05%胰蛋白胨。

分离体表或鳃等病变部位的病原菌，取病灶物少许，接种于适宜的培养基中，然后在固体培养基中再进行划线分离。也可用接种环挑取病灶材料直接划线分离。如分离内部组织器官的病原菌时，在解剖前先将纱布放在0．1%的升汞或70%的酒精中，浸泡3～5分钟后，取出覆盖在鱼的体表上。经灭菌作用后，剖开鱼腹，用灼热铁片局部烫肝、肾等器官表面组织，然后用无菌接种环取材料直接分离，或用无菌吸管吸取脓肿状物进行培养、分离。如用接种的血液，从心脏或尾柄处采血，先把第一滴血排除，留第二、第三滴血接种于培养基中，或用无菌接种针从心房处的烫过部位刺入，而后再进行划线分离。

把接种过的培养基，置于20～28℃恒温处，培养24～28小时后，用放大镜或低倍显微镜观察，挑取单个可疑菌落转移到试管培养基中进行纯培养，以做菌种的毒力试验或分类鉴定之用。

（3）人工感染试验。在20～28℃温度条件下，培养出纯的菌液，接种到健康鱼体上进行感染试验，以确定其毒力。

人工接种感染的方法有浸洗、涂抹、口服、注射等多种。采取哪种方法，要视不同的疾病类型和病原体侵入途径来确定。假如是体表疾病，可采用浸洗或涂抹法；如是内部疾病，可选用口服法或注射法进行。浸洗法是根据所要求的浓度，把一定量的菌液加入带水的试验缸中，让健康的鱼在此水中浸洗感染一定的时间，然后再把鱼捞出，转养于其他清水缸中，观察其致病情况。涂抹法是将菌液涂抹在鱼体相应的轻度擦伤部位，然后把鱼放在清水缸中进行观察。注射法是把菌液注射到鱼体腹腔或肌肉内，注射部位一般可在各个鳍的基部位置，注射时针头要向靠近鳍片基部方向注入，切忌伤及内脏。口服法是把菌液经口灌注或拌入饲料中投喂，来达到体内感染的目的。

利用人工培养基分离致病细菌，应该反复进行人工感染试验，确定了病原菌后，方可大量培养作为疫菌制备的材料。

2．抗原的灭活

（1）死疫菌苗制备时，无论是细菌，还是病毒，都需要经过灭活处理。一般常用福尔马林液，浓度是0．1%～0．3%，或者采用热灭活法，60～65℃水浴2～4小时。

（2）活疫菌苗是通过异体动物或细胞对病原体进行培养驯化后，选用弱毒株制成的。这种疫苗接种机体后，既不会使鱼出现病症，病原体又可在鱼体内生活，从而刺激抗体的产生。

3．安全试验及保护率问题 抗病提纯后，在使用前要进行安全性试验和保护率测定工作。

（1）安全试验。活疫苗虽然具有免疫力强的优点，但有一个很大的缺点，就是当鱼体抵抗力较弱时，活疫苗可能会引起致病；这些活疫苗在鱼体上一代又一代传下去，也会恢复致病性。因此，在使用疫苗前，一定要进行安全性试验。疫苗在使用前，除做一般无菌检验外，还需要进行正常的鱼体试验，也就是取制备的土法疫苗，给健康的鱼注射不小于使用量的疫苗（一般每尾注射0．2～0．5毫升），把注射过疫苗的鱼单独放在27℃的水泥池或水缸中饲养，观察鱼的健康状况，待半个月后，若无出血病出现，证明该批疫苗是无毒性的，才可进行大批的安全使用。

（2）保护率确定。把疫苗按规定接种到健康的鱼体上，一般每尾健康草鱼注射0．2～0．5毫升。经1个月饲养后，再用0．1%浓度的病毒悬液，每尾注射0．2～0．5毫升，放在25～28℃的水泥池或水缸中单养，观察半个月左右。同时设不注射疫苗的对照组，在半月内如果对照组出现出血病，免疫组也同样发生出血病，证明该疫苗无效；若免疫组不发生出血病，说明该疫苗已有一定的保护率，方可作疫苗使用。保护率测定也可在实验室中进行，用检测抗体或血清学等方法进行。保护率测定后，应得出疫苗使用的最适剂量，便于生产运用。

4．疫苗的保存

（1）死疫苗加入防腐剂后置于普通的冰箱（4℃），可保存1～2年，有条件的还可作冻干处理，保存期则更长。

（2）活疫苗一般不宜保存，在运输过程中也需置于冰瓶中。不管采用哪种方法，在使用前均需做效价测定。在生产疫苗时，应标明疫苗的保存方法和有效期，以供生产单位参照使用。