鱼类免疫制剂的作用原理及使用方法

一、鱼类免疫学的作用原理

鱼类免疫系统的研究已成为一门新的学科，不仅从系统发育研究脊椎动物免疫系统的进化规律，也为研制鱼用疫苗来提高鱼体免疫功能和促进渔业发展提供了理论依据。免疫系统是指机体识别和消除“异物”的一个防卫系统，它的主要功能是防御和维护自身稳定。鱼类免疫系统包括免疫组织和器官、免疫细胞和体液免疫因子。

1.鱼类免疫系统的组织和器官

鱼类的免疫器官与组织主要包括胸腺、肾脏、脾脏、粘膜相关淋巴组织，它与哺乳动物在免疫器官组成上的主要区别在于没有骨髓和淋巴结。

胸腺 鱼类胸腺起源于胚胎发育的咽囊，一般认为是鱼类的中枢免疫器官。胸腺是鱼类淋巴细胞增殖分化的主要场所，并向血液和外周淋巴器官输送淋巴细胞。胸腺是T细胞的发源地，主要承担细胞免疫的功能。另外，鱼类胸腺随着性成熟和年龄的增长或在外环境的胁迫下会发生退化，草鱼从鱼苗到Ⅰ龄或Ⅱ龄，胸腺内淋巴细胞增殖较快，是草鱼免疫系统发育成熟的重要时期，Ⅱ龄以上的草鱼开始出现年龄性胸腺退化现象。在养殖不良的情况下，正常Ⅰ龄草鱼胸腺器官会产生萎缩退化(即非年龄性胸腺退化)。Alvarea的研究认为在一年内不同季节胸腺细胞的数量、胸腺大小也呈现出规律性的变化。

肾脏 肾脏是成鱼最重要的淋巴组织，可分为头肾、中肾和后肾。在肾脏的发育过程中，头肾失去排泄功能，保留了造血和内分泌的功能，而成为造血器官和免疫器官。鱼类头肾是继胸腺之后第2个发育的免疫器官，不依赖抗原刺激可以产生红细胞和B淋巴细胞等，相当于哺乳动物的骨髓。另一方面，受抗原刺激，头肾和中肾细胞会出现增生，利用溶血空斑和免疫酶技术已经证实头肾和中肾都存在抗体产生细胞，表明肾脏又是硬骨鱼类重要的抗体产生器官，相当于哺乳动物中的淋巴结。因此,硬骨鱼类的肾脏有哺乳动物中枢免疫器官及外周免疫器官的双重功能。

脾脏 脾脏是鱼类红细胞、中性粒细胞产生、贮存和成熟的主要场所。有颌鱼类才出现真正的脾脏，软骨鱼的脾脏可分为红髓和白髓，包括椭圆形的淋巴小泡，内有大量淋巴细胞、巨噬细胞。硬骨鱼类的脾脏虽没有明显的红髓和白髓，但同时具有造血和免疫功能。有研究表明，硬骨鱼类在受到免疫接种后，其脾、肾等免疫器官的巨噬细胞增多，可与淋巴细胞和抗体聚集在一起，其作用是参与体液免疫和炎症反应。对内源或外源异物进行贮存、破坏和脱毒。作为记忆细胞的原始发生中心；保护组织免除自由基损伤。

粘膜和相关淋巴组织 鱼类除了有以上重要的免疫器官结构，被称之为粘膜相关淋巴组织，包括淋巴细胞、巨噬细胞和各类粒细胞等，当鱼体受到抗原刺激时，巨噬细胞可以对抗原进行处理和呈递，抗体分泌细胞会分泌特异性抗体，与粘液中溶菌酶、抗蛋白酶、转移因子、补体、几丁质酶等物质一起组成抵御病原微生物的有效防线。

2.自然免疫

鱼类虽是低等脊椎动物，但已具备免疫的基本特性。与哺乳动物一样，其体内也存在有自然免疫应答和获得性免疫应答。当遇病原后，首先并迅速起防卫作用的免疫应答称为自然免疫应答。在体内执行自然免疫应答的有吞噬细胞，自然杀伤细胞及血液和体液中存在的抗菌分子，在鱼类防止感染中扮演重要角色。一般分为 4 道防线，存在于粘膜分泌物中蛋白酶、溶菌酶、凝集素、补体、转移因子等非特异性抵抗作用的分子是第一道防线，粘液细胞是第二道防线，血细胞特别是颗粒细胞和单核细胞能够破坏存在于循环系统中的微生物充当第三道防线，最后是存在于器官和组织中的具吞噬作用的细胞，如内皮细胞、巨噬细胞、颗粒细胞等，这四道防线虽对外源微生物、病菌和抗原没有特异性，但能有效地清除、降解病原微生物及其他有害物质。近年来，随着多种自然免疫识别分子的发现，对自然免疫机理的研究已成为热点，并提出“模式识别受体概念”，提示了天然免疫识别分子识别不同病菌的机制，这具有重要的免疫学意义。

（1）非特异性体液因子

存在于鱼类血液或粘液中的具有非特异性抵抗作用的分子包括：补体、干扰素、凝集素、溶菌酶、急性期蛋白等，这些物质的作用是 ①直接分解细菌或真菌，如溶菌酶、补体。②抑制细菌或病毒的复制，如急性期蛋白能使真菌、细菌和寄生虫的糖类和磷酸脂产生沉淀。③作为调理素增加吞噬细胞的吞噬量或中和细菌。

补体 补体是鱼类抵抗微生物感染的重要成分，存在于血清中，C3是补体系统的主要成分，七鳃鳗的C3仅通过旁路激活，而且其补体系统的主要作用不是促使靶细胞溶解，而是促进吞噬细胞的吞噬作用。随着鱼类的进化，出现了补体的经典激活途径，利用补体参与靶细胞溶解和调理作用，但鱼类的补体较哺乳动物的补体对热敏感，哺乳动物的补体在54℃加热20分钟失活，而鱼类补体于45℃加热20分钟即失活，且活性受外界温度的影响较大，春季的杀菌活性比秋季高。鱼类还有分散的淋巴细胞生发中心，它们存在于粘液组织，如皮肤、鳃和消化道等，但不具备完整的淋巴补体反应，除经典途径外尚有替代途径，其重要意义在于它不需要抗体的参与而可被革兰阳性菌和阴性菌中的脂多糖等激活，这样就强化和扩大了补体的作用。

干扰素 干扰素是脊椎动物体内的能诱导细胞产生抗病毒蛋白质的一种可溶性蛋白。自1965 年首次发现鱼类干扰素活性物质以来，陆续在鲦鱼、虹鳟、酯科鱼类、大麻哈鱼、鲤鱼、草鱼、金鱼等鱼体和培养细胞系检测到干扰素，它主要由巨噬细胞分泌，生成速度受温度影响。邵健忠等用草鱼出血病病毒诱导草鱼产生干扰素，在25℃水温下诱导3天，其活性达到高峰。近年来的研究表明，鱼类干扰素的抗病毒机制类似于哺乳动物的干扰素，表现出在同种细胞上具有广谱的抗病毒活性，但在不同种属细胞间具有相对的抗病毒特异性。目前对鱼类干扰素的研究尚处于起步阶段，由于缺乏与高等脊椎动物干扰素的系统比较和分子生物学方面的深入研究，因此有关鱼类干扰素的性质尚无最后定论。

凝集素 凝集素是一种对特异糖残基有高度亲合力的蛋白质。目前有关鱼类凝集素的研究报道很少，仅从草鱼、欧洲鳗鲡和虹鳟的血清以及斑点叉尾鱼回的分泌液和鲶鱼皮肤、粘液中检查出对某些细菌和红血球具有凝集作用的自然凝集素。1979年Voss等发现大麻哈鱼卵中含有母源性凝集素，并进行了纯化和活性研究，发现此凝集素具有抑制鱼类病原性细菌的生长。关于鱼类卵中凝集素的功能，据推测与调节碳水化合物代谢、阻止多精入卵、形成受精膜、促进受精卵的有丝分裂、调理病原体以及杀菌等作用。从进化的角度来看，鱼类虽然已可产生抗体，但仅有Ig M，且功能也尚未完善，凝集素的存在可能在一定程度上弥补了这方面的不足，它能有效地识别和凝集异已成分，从而有利于异物的清除。因此，有可能作为防止感染性微生物侵入的第一道防线，起着防御作用。

溶菌酶 溶菌酶存在于鱼类的粘液、血清、吞噬细胞和单核细胞的胞浆内。鱼类溶菌酶的活性受季节影响，夏季的活性比冬季增加2～3 倍，这可能是鱼类的季节性疾病发生的原因之一。溶菌酶通过酶解病原体细胞壁的粘多糖将其杀死，因此溶菌酶的水平和活性直接关系到鱼类的免疫能力和健康。

C2反应蛋白 鱼类血清的正常组分中含有C 反应蛋白，它能使多种真菌、寄生虫及细菌含有的糖基以及磷脂酶分子产生沉淀，从而有助于降低病原体的毒力，使吞噬细胞对之易于攻击，同时还能促进吞噬、激活补体、抑制血小板功能。

吞噬细胞 鱼类吞噬细胞是组成非特异性防御系统的重要成分。在抵御微生物感染的各个阶段发挥重要作用。鱼类的吞噬细胞主要有单核细胞、巨噬细胞和各种粒细胞，受到微生物侵扰时，机体炎症反应的核心细胞是巨噬细胞和粒细胞，它们能够被微生物的有害产物激活，并产生更多更有效的抗微生物因子。鱼类的单核细胞与哺乳动物相似，有较多的胞质突起，可进行活跃的变形运动，具有较强的粘附和吞噬能力，能够在血流中对异物和衰老的细胞进行吞噬消化。粒细胞中嗜中性粒细胞是硬骨鱼类中最常见的一类，鱼类是否存在嗜酸性和嗜碱性粒细胞，还存在较大的争议。嗜中性粒细胞具有活跃的吞噬和杀伤功能，但其吞噬能力一般比单核细胞弱。吞噬细胞在不同组织中有不同的类型，有学者在鲫头肾白细胞培养物中分离出形态、细胞化学和作用机制不同的 3 类巨噬细胞。由于分离纯化巨噬细胞较容易，因此对鱼类巨噬细胞在免疫系统中的作用亦得到了充分的研究。鱼类的巨噬细胞不仅具有杀伤细菌及寄生虫的作用，还可分泌多种在免疫学上重要的分子，如细胞因子和二十碳四烯酸等。巨噬细胞接触病原微生物后，会引起呼吸爆发，还能够生成肿瘤坏死因子。另外，巨噬细胞可以通过对其表面组织相容性复合体分子中抗原的呈递、对淋巴细胞功能的调节、对自身及其它细胞生长复制的控制等途径来操纵机体的免疫应答。新近研究表明，对鱼类巨噬细胞凝集或黑色素巨噬细胞中心的检测，可成为衡量鱼体健康水平及环境污染状况的生物标志。

（2）自然免疫应答的调节

鱼类的先天性防御机制受多种因素的影响，如温度、污染、微生物及病毒的侵害，都会影响鱼体固有的免疫应答能力，这些因素被称为环境应激因子。在正常情况下，鱼类吞噬细胞的吞噬能力明显地受环境温度的影响。目前环境污染对鱼体免疫功能的影响研究报导很多，早在1935年Dowson就发现鲶鱼长期置于含铅水体中，其脾脏增大，有相当比例的吞噬细胞退化。Betoulle的研究发现，植物杀虫剂林丹通过影响虹鳟鱼头肾吞噬细胞和外周血淋巴细胞内Ca2+的浓度而导致细胞的凋亡和功能的减退。1994年Wester等曾论述了鱼类免疫毒理学标志物有: ①结构性参数，如:免疫细胞数量、比例、免疫器官的重量、形态、血清蛋白等。②免疫调节功能参数，如对疾病的易感性、吞噬细胞的趋化性、吞噬能力和胞饮作用等。然而鱼类免疫毒理学标志物的进一步确立和完善仍需对免疫机制进行深入探索。这些研究在提高鱼类健康水平，增强先天性抗病能力方面无疑具有重大的意义。1985年Olivier等关于单独用弗氏完全佐剂注射银大麻哈鱼能提高抗结疖病的免疫力的研究揭开了免疫刺激剂提高鱼类非特异性免疫研究的序幕，虽然至今只有十几年的历史，但有关鱼类非特异性免疫机制的调节研究却很多，已有的免疫增强剂主要是灭活的细菌及细菌多肽、左旋咪唑、几丁质、葡萄糖等以及一些维生素和激素。我国的鱼病研究工作者对免疫刺激剂与鱼类非特异免疫的关系也做了许多，如马俊岭用免疫多糖预防草鱼病的研究表明，口服2%～3%的免疫多糖能提高草鱼血清中的溶菌酶活力和超氧化物歧化酶的活性。蔡中华研究了中草药大黄、黄连、花粉等对鲤鱼非特异性免疫功能的影响，结果表明：吞噬细胞吞噬能力、溶菌酶活性增加。虽然免疫刺激剂对提高鱼类非特异性免疫力的研究刚刚起步，但由于它对病原微生物的抵抗力具有广泛性，已引起鱼病专家和养殖专家的高度重视。目前所使用的疫苗可分为灭活疫苗、减毒活菌苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗等，采用的方法有注射、口服、浸浴和喷雾等。各种方法各有利弊，由于至今对疫苗进入鱼体的机制还很不了解，对免疫原是以可溶性还是以颗粒性方式进入鱼体为佳还存在很大的争议，因此对各种方法的使用效果也存在不同的看法。

3.细胞免疫

细胞免疫是由T 细胞介导的细胞免疫应答，T 细胞具有直接杀伤细胞的作用以及通过分泌细胞因子调节免疫反应的作用。到目前为止，尚未见能用来区分T 细胞的单克隆抗体。Miller等虽然研究出的单抗可与一种鲶鱼的T细胞发生反应，但它同时又与中性粒细胞和凝血细胞发生交叉反应。鱼类中的T淋巴细胞与哺乳动物的T淋巴细胞有所不同，哺乳动物的T淋巴细胞是通过特异表面标记特征来确认的，而鱼类中至今未见报道，所以对T细胞一直都以其功能来加以确认。但目前已确认鱼类至少有功能性的T细胞存在。鱼类的细胞免疫包括迟发型变态反应、淋巴细胞直接参加的细胞毒性、移植物排斥反应、巨噬细胞游走抑制和混合淋巴细胞反应等。真骨鱼中存在着上述大部分免疫现象，从特异性刺激免疫的发育过程来看，细胞介导免疫系统要早于体液免疫，对虹鳟和鲤的研究表明，孵育后2～4周，细胞介导免疫系统已成熟，体液免疫则在4周以后才形成，特别是对胸腺依赖性抗原的体液免疫系统，形成更晚，要到第8 周以后。

体液免疫 体液免疫是指机体受抗原刺激，淋巴细胞分化增殖，产生免疫球蛋白的应答过程。鱼类的体液免疫与高等脊椎动物的体液免疫有较大的差异，如软骨鱼只有Ig M和Ig G 2种抗体，而真骨鱼则可能只有Ig M一种抗体；鱼类的抗体形成期较长，抗体滴度增高缓慢，但初次免疫后的免疫期较长；鱼类的免疫记忆只是一种简单的抗原灶扩散，二次免疫后抗体滴度增高较少，而且免疫记忆还受温度的影响。鱼类的Ig M不仅存在于血清中，还存在于皮肤、肠粘液、胆汁和卵中。目前粘液抗体的来源还存在争议，有人认为是血清抗体，也有人认为是粘膜浆细胞所分泌的。Lobb和Clem等曾提出了鱼类存在分泌型免疫系统的假说，他们认为鱼类的皮肤和胆汁中存在着一种由局部产生的分泌型免疫球蛋白(SIg)，其结构与血清抗体不同。但也有资料表明，粘液性Ig和血清Ig在许多方面是相同的。

获得性免疫应答的影响因素 目前对鱼类适应免疫应答的影响因素的研究报道也很多，主要有抗原、个体发育和环境因素等。抗原的性质、剂量及进入机体的途径对鱼类免疫应答都有显著的影响。一般认为大分子颗粒性物质抗原性较强，病毒和细菌等都是较好的抗原。佐剂是一种非特异性的增强或改变疫苗免疫应答的物质，一般认为能增加抗原的免疫应答。

获得性免疫应答及调节 参与鱼类适应性免疫应答的细胞主要是淋巴细胞。对于鱼类淋巴细胞的异质性，早在70年代就提出来了，目前利用半抗原-载体效应和单克隆抗体等技术已经证实鱼类的淋巴细胞也包括T细胞和B细胞两个亚群。在真骨鱼类中对淋巴细胞分类是这样定义的：B淋巴细胞能表达表面膜免疫球蛋白(Ig)，而不能产生免疫球蛋白的淋巴细胞即为T淋巴细胞。研究结果表明，鱼类胸腺与T淋巴细胞有关，头肾与B淋巴细胞有关，脾脏中有T和B2种类型的淋巴细胞，延长在机体内存留时间，增强细胞介导的致敏反应能力，但也有学者对此持否定态度，认为佐剂会导致免疫鱼腹膜纤维坏死，肝脏与胰脏慢性损伤等。此外，免疫途径对免疫应答也有影响，一般认为注射方法获得的免疫效应最强。从个体发育来看，不同时期机体的免疫应答能力也不相同。研究表明，鱼的体质量、年龄、营养状况均影响鱼类的免疫应答，而且体质量比年龄更能影响鱼类的免疫应答；幼鱼对抗原较为敏感，而成鱼则相反。对鱼类免疫应答影响最大的环境因素是温度，早在1935年，Nybelin就发现，鳗鲡在8℃的水温中，检测不到对鳗弧菌的凝集抗体，而在18℃时则相反，以后许多试验证明，低温能延缓或抑制鱼类抗体的生成。一般认为在一定温度范围内温度越高，生成抗体的效价越高，产生应答的速度越快。鱼类的免疫临界温度因鱼种不同而异，一般温水性鱼类的免疫临界温度较高，冷水性鱼类较低。但也有学者认为水温与鱼类免疫应答之间的关系并非简单的增函数关系，杨先乐的草鱼试验表明，在适宜生长温度20～32℃草鱼的免疫应答反应基本处于较高水平，在营养、溶氧、日照等其它条件不变的情况下，一般不再随温度的变化而变化，而当温度超过它的适宜生长温度，其免疫应答反而有下降趋势。目前就温度对免疫应答影响的机制，有观点认为是低温导致T细胞受抑制所致，而非B淋巴细胞受抑制。Avtalion(1973)和杨先乐(1997)则认为低温仅抑制初次应答的诱导期，只要鱼体在临界温度以上与抗原有过短期的接触，则无论以后环境水温如何，将会正常地产生抗体，这一结论对生产上鱼类疫苗的使用时机的选择具有重要意义。

4.母源性免疫

大多数鱼类在其仔鱼阶段特异性免疫器官尚未发育完全，还不能实行其功能，仔鱼对外界病原微生物的抵御能力只能靠自身的非特异性免疫和来自母体免疫，即母源性免疫。最初一些学者推测，亲鱼的免疫作用可以通过卵子，抗体被动地转移，使其仔鱼获得一定的保护作用。目前，越来越多的实验证据表明，在鱼类卵母细胞或胚胎中存在凝集素、溶菌酶和Ig M。由于卵母细胞、受精卵和胚胎中均不能合成凝集素、溶菌酶和Ig M，它们被认为是来源于母体的自然免疫物质，在硬骨鱼类胚胎发育和早期胚后发育中可能起着重要的作用。在1992年Fuda已成功地从大麻哈鱼成熟卵母细胞分离纯化到Ig M。Avtalion和Mor从罗非鱼纯化到Ig M。Avtalion和Mo从罗非鱼受精卵分离得到了Ig M。目前，对水体中病原微生物对鱼类胚胎和胚后发育阶段的危害的研究还很少见到。在鲑科鱼类，已发现鲑肾细菌可由母体进入卵，使胚胎染毒并在以后发育中发病，这表明在鱼类胚胎发育过程中的确会受到病原微生物的侵害，因此，母源性免疫力的发现不仅具有理论意义，而且在养殖生产上也具有潜在的应用价值。人们试图增加卵中凝集素、溶菌酶或Ig M含量来获得高免疫力的鱼苗，但到目前为止母源免疫力对胚胎的保护作用以及与自身免疫系统的发育和功能的完善的关系尚值得进一步的研究。

总之对鱼类免疫学的研究，近些年来得到了鱼类学家和免疫学家的广泛重视。鱼类免疫学也得到了长足的进步和发展，这不仅对研究免疫系统的进化有巨大的理论意义，也为鱼类的防病、治病，促进渔业发展开拓了广阔的前景。但鱼类免疫学所需要研究的对象远远不止这些，各种鱼类的免疫特异性又错综复杂，总体鱼类免疫机制的研究还很不系统和完善，因此还需要从事鱼类免疫研究工作者付出艰辛的努力。

二、鱼类免疫制剂使用方法

（一）病毒灭活疫苗制备

1.草鱼出血病组织疫苗的制备

（1）选择典型病状的草鱼（赤皮病、烂鳃病、肠炎病），用酒精或碘酒消毒鱼体表，消毒剪刀从肛门向前剪去腹部一侧，用消毒镊子取出肝、脾、肾组织，称重后放在组织匀浆器中磨成糊状，加入10倍0.80%生理盐水，用双层纱布过滤，弃去滤渣，即成原毒组织浆。反复冻融后，原毒组织浆用离心机3000～5000转/分钟，离心30分钟，取上清，加入青霉素1000 IU/毫升和链霉素1000微克/毫升，即为草鱼出血病病毒悬液，4℃保存备用。

（2）取草鱼出血病病毒悬液，背鳍基部或胸鳍基部注射感染50～100克/尾的当年草鱼鱼种，注射剂量为0.2毫升/尾。28～30℃水箱中饲养，待感染的草鱼鱼种出现典型病症后，收集发病草鱼的肝、脾、肾、肠及肌肉组织。

（3）收集组织，按方法（1）制成草鱼出血病活苗。

（4）灭活：取上述已制备的活苗，加入青霉素1000 IU/毫升和链霉素1000微克/毫升，放入水浴锅内加温保持60～65℃灭活2小时。

（5）防腐保存：对已灭活的疫苗即加入0.5%～1.0%福尔马林，封瓶口，4℃冰箱保存备用。一般保存期为6～10个月。如果没有冰箱，在阴凉处可保存1.5个月，但放置过久会影响疫苗的效价。

（6）安全试验：取上述疫苗，加入同体积生理盐水，注射规格为10厘米/尾，草鱼5～10尾，0.2～0.3毫升/尾，28～30℃水簇箱中饲养，7天内无死鱼，即属安全疫苗。

（7）免疫保护率测定：取上述疫苗，加入同体积生理盐水。注射草鱼网箱内饲养30～60天，规格为10厘米/尾，20～40尾，草鱼出血病疫苗注射量0.2～0.3毫升/尾。测定时设3个攻毒试验组和3个攻毒对照组，每组注射草鱼种10尾，28～30℃水簇箱中饲养7～15天，统计死亡率。注射免疫保护率为80%以上时为合格疫苗。

2.草鱼出血病细胞疫苗的制备

（1）敏感细胞的培养，用TC-199培养基，扩大培养ZC-7901草鱼吻端细胞株（或CIK草鱼肾细胞系、CP-80草鱼胚胎细胞系）。

（2）选择典型病状的草鱼（赤皮病、烂鳃病、肠炎病），用 70%酒精或碘酒消毒鱼体表，取肝、脾、肾组织，称重后放在组织匀浆器中磨成糊状，加入10倍0.80%生理盐水，双层纱布过滤，弃去滤渣，即成原毒组织浆。反复冻融后，原毒组织浆用离心机3000～5000转/分钟，离心30分钟，取上清，加入青霉素1000 IU/毫升和链霉素1000微克/毫升，在无菌室中用0.22微克滤膜过滤后制成无菌草鱼出血病病毒悬液，4℃保存备用。

（3）ZC-7901草鱼吻端细胞株注培养基后，加入无菌草鱼出血病病毒悬液3毫升，吸附0.5～1.0小时后，加注病毒悬液，继续加入TC199培养基培养和传代，待细胞出现明显细胞病变（CPE）后，置-18℃，反复冻融后待用。

（4）将ZC-7901草鱼吻端细胞株接种于旋转细胞扩大瓶，培养2～3天后，按步骤（3）接种制备的病毒液，传代培养。培养至第15代时开始收获病毒培养物，反复冻融。

（5）将反复冻融的病毒培养物，接种于未感染病毒的 ZC-7901 草鱼吻端细胞株测定TCID50，或直接注射草鱼，测定培养物的毒力。

（6）将反复冻融的病毒培养物用PBS（平衡盐溶液）稀释后，加入0.1%福尔马林，于37℃灭活48小时。制备成草鱼出血病细胞疫苗。

（7）安全试验：取上述疫苗，加入同体积生理盐水，注射规格为10厘米/尾，草鱼5～10尾，0.2～0.3毫升/尾，28～30℃水簇箱中饲养，7天内无死鱼，即属安全疫苗。

（8）免疫保护率测定：取上述疫苗，加入同体积生理盐水。注射草鱼网箱内饲养30～60天，规格为10厘米/尾，20～40尾，草鱼出血病疫苗注射量0.2～0.3毫升/尾。测定时设3个攻毒试验组和3个攻毒对照组，每组注射草鱼种10尾，28～30℃水簇箱中饲养7～15天，统计死亡率。注射免疫保护率为80%以上时为合格疫苗。

（二）细菌疫苗的制备

嗜水气单胞菌疫苗的制备

（1）病原菌：嗜水气单胞菌，血清型为O5或O9。

（2）菌种的培养：嗜水气单胞菌菌株划线接种于琼脂平皿，30℃培养18～24小时，生长出菌落，再挑取适量单菌落接种于盛200毫升肉汁胨培养基三角瓶中(p H 7.2)，30℃振荡培养(振荡频率为120～130次/分)，培养18～24小时，备用。

（3）菌种扩大培养：菌种可继续用三角瓶进行扩大培养，接种量为10%，培养方法同菌种的培养，但用摇床培养时，产量较低，因此一般采用发酵罐培养。

细菌发酵罐培养一般采用气升发酵罐，发酵罐的体积有50升、100升、500升及数吨的发酵罐等不同规格，根据产量而定，培养的方法为：

将已培养的菌种，按10%的接种量接种于种子罐，通气培养18～24小时后，转接于发酵罐培养，通气培养18～24小时。发酵培养的条件为通气量为10～18升/分钟，罐压为0.05～0.1MPa，培养基用肉汁胨培养基，p H值7.0～7.2，培养温度为30℃，培养时间为18～24小时。

（4）半成品检验

纯粹性检验：无菌取培养的菌液数毫升，涂布于普通营养琼脂平板，置30℃培养18～24小时后，观察细菌生长情况，要求无杂菌生长。

菌含量测定：细菌含量可采用平板计数，也将培养的细菌作适当稀释后，可用分光光度法测定细菌的OD560值，按以下公式计算：

X＝（18.76Y-0.73）×D

式中：X-细菌浓度（CFU/毫升）； Y-测定的OD560值；D-稀释倍数。

（5）菌苗制备：以0.4％福尔马林溶液，37℃灭活24小时，分装，封口，贴标签，即制成灭活嗜水气单胞菌菌苗。

（6）嗜水气单胞菌菌苗的质量控制

外观：该疫苗外观呈淡黄色，瓶底有白色沉淀，摇匀呈均匀混浊。

纯粹性检验：该菌液涂布于普通琼脂平板上，28℃培养18～24小时后，平板上无嗜水气单胞菌和其它杂菌生长。

细菌浓度：细菌浓度按半成品检验中菌含量测定方法进行，菌浓度应≥50×108CFU/毫升。

安全性检查：取成品菌苗稀释至50×107CFU/毫升，腹腔注射10尾健康的鲫鱼，注射剂量按鱼体的大小，每尾注射为0.2～0.5毫升，注射后在水温28～30℃水簇箱内饲养7天，同时设空白对照。要求菌苗注射后，鲫鱼的成活率为100%。

免疫保护力的测定：取上述菌苗，注射同规格鲫鱼20～40尾，0.2～0.5毫升/尾，饲养于网箱内30～60天后，用同源的强毒株菌种攻毒，28～30℃水簇箱中饲养7天，统计死亡率。注射免疫保护率为80%以上，浸泡免疫的保护力为70%以上的疫苗为合格疫苗。

三、常用的生物制剂及使用方法

1.常用生物制剂种类

生物制剂是一类商品渔药制剂是指经国家兽药药政部门审批，工商管理部门批准的企业生产允许进入市场销售的，专门适用于养殖渔业中为加强机体健康、防治病害和改善养殖环境、提高产量的药物制品。因此，作为商品渔药制剂面市时，必须标明批准文号、注册商标、产品质量标准、生产厂家和出厂日期；也应按药物规定列出主要成分、性状、作用与用途、用法与用量、注意事项、规格、有效期和停药期等内容和说明，以利消费者正确使用。

目前我国生产的商品生物制剂有：

目前我国生产的疫苗主要是草鱼出血病灭活疫苗，产品有二大类：一类是草鱼出血病组织浆灭活疫苗，是利用天然发病或人工感染发病鱼的肝、脾、肾等组织，经科学的疫苗制备方法制成。另一类是草鱼出血病细胞培养灭活疫苗，是利用细胞培养病毒后，经疫苗制备方法制成。这二类疫苗均有较好的兔疫力，但以后者的质量较好，且稳定。

细菌病疫苗，如嗜水气单胞菌败血症疫苗。主要有O5和O9两个血清型。而且仅能对同型菌株具保护力，而嗜水气单胞菌的O抗原结构复杂多变，因此，在菌苗制备时，需根据不同地区的流行的嗜水气单胞菌血清型的不同而制备不同的菌苗，或采用同时含O5和O9两种菌株的多价菌苗。

2.免疫接种方法

兔疫接种方法现有二种。其一是注射法，即用医用注射器或鱼用连续注射器。将疫苗注入鱼的体腔肉内。注射部位以腹鳞基部斜向进针最好，不易损伤鱼体。注射剂量视鱼体大小而定，兔疫接种虽然需逐尾鱼注射，比较麻烦，然而从实际操作经验来看，由于免疫效果稳定也较好，因此仍在养殖生产中广泛应用。免疫注射前，最好用的晶体敌百虫对鱼体进行浸洗消毒，既杀了体表寄生虫，又可减少因鱼挣扎受伤。

另一类免疫接种法是浸泡法。即将疫苗配成一定的浓度后，将鱼种放置于浸泡液中浸泡一定的时间后，取出放进鱼池。由于灭活疫苗并无感染能力，因此浸泡前常采取理化方法促使疫苗进入鱼体。常用的有高渗法，即浸泡疫苗前，先将鱼放入存有 3%～5%的食盐溶液中浸泡5分钟后，再将鱼移到疫苗溶液中浸泡，利用渗透压的改变，强迫疫苗中的抗原进入鱼体。此法较方便，但免疫效果较注射法稍差。

免疫防病是国内近年来研究的成果。现在有不少单位制备了细菌疫苗、活毒疫苗等。由于这方面的研究尚有探索，各地应慎重使用，以免造成更大的危害。

当今的商品渔药制剂，除了少数特殊用途的制品外，如疫苗、催产剂、诊断试剂等，绝大多数都是利用医药、兽药的原药、辅药等加工复配而成。但是制剂中选用的原、辅药，配伍比例及药物剂型等，完全是依据药物的作用对象和作用目标确定的。因此其用途明确，效果通常优于原药，但使用过程中需注意停药期。