用液相色谱－质谱法分离鉴定药物

一、 实验目的

（1） 了解液相色谱-质谱联用的基本原理。

（2） 掌握液相色谱-质谱联用时的操作步骤及实验方法。

（3） 学习分析色谱图和质谱图。

二、 实验原理

液相色谱-质谱法（Liquid Chromatography／Mass Spectrometry， LC-MS）将应用范围极广的分离方法——液相色谱法与灵敏、 专属、 能提供分子量和结构信息的质谱法结合起来， 是一种重要的现代分离分析技术。

LC-MS经历了约30年的发展， 直至采用了大气压离子化技术之后， 才发展成为常规应用的重要分离分析方法， 在生物、 医药、 化工、 农业和环境等各个领域均得到了广泛的应用。

不同的物质在固定相和流动相中具有不同的分配系数， 当两相作相对位移时， 这些物质在两相间进行反复多次分配， 这使得原来微小的分配差异产生明显的分离效果， 从而依先后次序流出色谱柱， 从而达到分离多种物质的目的。 依次流出的物质进入质谱中被打碎成为各种离子而被检测到， 从而达到分离分析的目的。

液相色谱仪包括溶剂输送系统（高压泵等）、 进样器、 色谱柱、 检测器等。 色谱柱和流动相的选择是样品中成分分离的关键。 本实验所用质谱仪为Agilent6520四极杆-飞行时间串联质谱仪， 该系统将高灵敏度、 质量精确度、 扫描间的动态范围完美地组合在一起， 而且还具有操作简单和可靠性高的特点。 Agilent Q-TOF在获得最大灵敏度的同时， 还可以保证采集速度或质量精确度。 它具有超高灵敏度， 可以分析痕量的样品。 Q-TOF系统对全扫描可以得到2ppm的精度， 而对MS／MS可以得到5ppm的精度。 系统可以进行全自动的调谐和质量轴校正， 以及参比离子在线自动输入。 谱图间的动态范围为5个数量级， 所以Q-TOF一次进样可以精确地检测更宽浓度范围的样品。

近年来， LC-MS已广泛应用于各种化学药物、 合成药物的分离分析， 成为临床化学试验、 临床用药监护以及药代动力学等领域必不可少的分离分析手段之一。 一些诸如甲硝唑的抗生素类药物， 由于其产生菌绝大多数是产生结构相似的多组分复合物， 用常规分析方法对其进行快速鉴别和相关物质分析比较困难， 液质联用技术以其强有力的分离分析能力， 在这类药物的成分分析和相关物质的鉴定上展示了巨大的优势。

本实验采用LC-MS对阿昔洛韦、 甲硝唑、 茶碱进行分离和结构鉴定。 阿昔洛韦、 甲硝唑、 茶碱的结构、 分子式、 分子量如图6-3所示。

图6－3 各被测物的结构、 分子式和分子量

（a） 阿昔洛韦； （b） 甲硝唑； （c） 茶碱

三、 仪器和试剂

1. 仪器

（1） Agilent6520Q-TOFLC-MS；

（2） 色谱柱：Agilent SB-C18柱（3.0mm×100mm×1.8μm）。

2. 试剂

（1） 阿昔洛韦（C8H11N5O3，225.0862）；

（2） 甲硝唑（C6H9N3O3，171.0644）；

（3） 茶碱（CH8N4O2，180.0647）；

（4） 甲醇： HPLC色谱纯；

（5） 超纯水。

四、 实验步骤

1. 设置数据采集参数

打开数据采集软件， 调用“JQDLC-MS-P.m”方法， 按下述条件设定仪器参数， 文件存放在指定文件夹下：

（1） 样品瓶位置： P1-A1。

（2） 色谱参数：流动相：水∶乙腈＝85∶15；流速：0.5m L·min-1；进样量：5μL；时间：5min； 检测器： ESI＋Q／TOF； 采集方式： MS。

（3） 质谱参数：Gas Temp：320℃；Dryinggas：10L·min-1；Nebulizer：30psi；Vcap：3500V； Fragmentor：125V； Skimmer：65V； Mass Range：50～3000m／z。

2. 数据采集

点击“RUN”， 开始进样分析。

3. 数据分析

打开数据分析软件， 调用数据， 得到混合物的总离子流（TIC）色谱图。 确定该图中每个峰分别是哪种物质， 分析它们的保留时间及出峰顺序不同的可能原因。

思 考 题

1. 什么是正相液相色谱（Normal Phase Liquid Chromatography， NPLC）和反相液相色谱（Reversed Phase Liquid Chromatography， RPLC）？ 解释为什么有机酸、 碱、 多肽和蛋白质常用RPLC分析？

2. 改变LC流动相配比， 对出峰时间及分离度有什么影响？