认识动物细胞培养室

时间：2022-10-19 百科知识版权反馈

【摘要】：根据体外培养细胞的生长特点和条件，一个无菌实验室或操作室、一个超净工作台和一个恒温培养箱是细胞培养的三大重要设施。一般细胞生长最适温度为37℃，并要求培养过程中温差变化不超过0.5℃。温度升高2℃细胞即不能耐受，若温度高于40℃，细胞很快就会死亡。f.当温度达到设定值，波动在±0.5℃以内，CO2浓度也达到要求后，即可进行细胞培养。

认识动物细胞培养室_动物细胞培养技术

任务1　认识动物细胞培养室

根据体外培养细胞的生长特点和条件，一个无菌实验室或操作室、一个超净工作台和一个恒温培养箱是细胞培养的三大重要设施。无菌实验室或操作室的设计原则是，有防止微生物污染和有害因素影响的措施，要求工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘。无菌实验室或操作室最好能单独设置。超净工作台也称净化工作台，这种工作台占据空间小，安装方便，操作简单，投资少，效果不比无菌实验室或操作室的效果差，即使不设置单独的无菌实验室或操作室，只要购置安装了超净工作台，也能进行简单的细胞培养工作。

一、细胞培养实验室的设计

设计细胞培养实验室时最基本、最需要保证的是，能进行无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。一般在细胞培养实验室能完成以下工作内容：①清洗工作；②配液工作；③消毒灭菌工作；④无菌操作；⑤细胞培养；⑥储藏工作。细胞培养实验室一般可分为以下几个操作区。

1.无菌操作区

无菌操作区（图1-13）是只限于细胞培养及其他无菌操作的区域。也可把超净工作台置于操作区中，这样更为安全。此区最好能与外界隔离，不能穿行或受其他因素干扰。操作区的大小依需要而定，一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。更衣间在外，主要供更换衣帽、鞋子等用。缓冲间位于更衣间与操作间之间，也可同时和几个操作间相通。操作间在内，主要供无菌操作和细胞培养用，房间应不受日光直射，大小适当，高度适宜（不超过2.5m）。

图1-13　无菌操作区

（1）更衣间。

①更衣间的作用：更换衣服（主要指白大褂），换鞋子（一般换成拖鞋），戴一次性口罩。

②更衣间的要求：更衣间是进入细胞培养室的第一道屏障，因此在更衣间的门上贴有“不是细胞培养室内需要的物品不准带入，是细胞培养室内需要的物品不准带出”的标示语。

③更衣间的消毒要求：每次实验前将紫外灯打开，30min后方可进入更衣间；在开紫外灯前，最好将更衣间里的白大褂尽可能地展开，以利于紫外线充分发挥作用。

（2）缓冲间。

①缓冲间的作用：缓冲间位于更衣间和操作间之间，主要目的是保证操作间的无菌要求，同时可在此完成一些简单的实验操作，如离心、观察细胞长势或进行简单的细胞计数等。

②缓冲间消毒的要求：实验人员进入缓冲间后，应先用消毒液浸泡双手，再用酒精棉擦拭手部，关键是手指甲部位，同时用消毒液浸泡拖鞋底部，以免细菌通过拖鞋进入操作间。

（3）操作间。

在操作间完成的工作内容主要有无菌操作和细胞培养。

操作间的要求如下。

①操作间自身要求：不宜太大，不宜太高。

②墙体光滑，易于清理消毒且无死角。

③对某些内置物的要求：工作台不宜紧靠墙壁，实验台面要光滑，并呈白色或灰色。

④消毒要求：每周用乳酸蒸气（或过氧乙酸）消毒1～2次；每次实验前用紫外灯消毒30min；每次实验后再用紫外灯消毒30min。

2.制备区

主要进行培养液及有关培养用液体的制备。

液体制备合格与否直接关系到组织细胞培养的成败，因此必须严格无菌操作。

3.储藏区

被储藏物品以及盛放这些物品的容器应清洁、无灰尘。

二、细胞培养实验室的设施

1.超净工作台

超净工作台（图1-14）种类繁多，主要有三大类：侧流式（图1-15）；直流式；外流式，或称为水平层流式（图1-16）。它们的基本工作原理大同小异：内设鼓风机，驱动空气通过高效滤器过滤净化后，让净化空气徐徐通过台面空间，使操作区构成无菌环境。

图1-14　超净工作台

图1-15　侧流式

图1-16　水平层流式

（1）超净工作台的使用方法：①安装在无阳光直射、无灰尘的房间内；②长时间未使用的，应在使用前彻底清洗、消毒；③用前打开紫外灯消毒30min，同时开启风机预热10～15min；④用后再次清洗消毒，或用75%酒精擦拭或开启紫外灯消毒30min。

（2）使用超净工作台时的注意事项：①操作区内摆放物品不宜太多；②凡进入超净工作台的物品的表面都要用75%酒精进行消毒处理；③在操作时不能对着操作区说话或打喷嚏；④实验结束后，将用后的、需做进一步处理的物品带出超净工作台，并按要求清理台面。

图1-17　隔水式恒温培养箱

2.恒温培养箱

用于细胞培养的培养箱分为普通电热恒温培养箱（简称恒温培养箱）和CO₂培养箱。

（1）恒温培养箱。

图1-17所示为隔水式恒温培养箱。

使用方法：先从进水口注水于不锈钢内胆，水位为溢水口下方2cm，然后接通电源，将需要培养的物品放入工作室内，关上工作室门，打开电源开关，设定好所需要的温度（数控，误差不大于0.5℃）。

注意事项：①严禁无水干烧，以免烧坏加热管，侧面接进水口软管，竖起时可看到水位；②仪器外壳应妥善接地，以免发生意外；③切勿将仪器倒置，以免水溢出；④为了减少水垢，建议选用蒸馏水。

（2）CO₂培养箱。

最适合于进行细胞培养的培养箱是CO₂培养箱（图1-18）。

一般细胞生长最适温度为37℃，并要求培养过程中温差变化不超过0.5℃。温度升高2℃细胞即不能耐受，若温度高于40℃，细胞很快就会死亡。因此，进行细胞培养需要温控特别精确的培养箱。

图1-18　CO₂培养箱

使用方法如下。

①接通电源前，先将箱内用酒精擦净，再用紫外灯或臭氧消毒器消毒1h。

②培养箱在水箱注水后才能正常工作。操作方法：插上电源，旋紧加水接头，旋开放水闷头，将加水水管接入箱体左侧上部加水口，打开电源开关，此时蜂鸣器响，操作面板低水位指示灯亮，注水至低水位指示灯灭后，继续注水至溢水口处有水溢出。关闭电源，拆除接管及加水接头。拉出放水管，放掉约100mL水后塞紧放水闷头，关闭电源开关。

③将CO₂专用减压阀装在CO₂钢瓶上，接头处不得漏气。将减压阀出口套上耐压胶管，并与CO₂培养箱后的进口相连接，随后用压紧圈固紧，接头处不得漏气。CO₂钢瓶气体总阀暂不打开。

④开机。

a.接通电源，总电源开关置于“1”处，电源指示灯亮。

b.将温度设定值调到需要的温度（如37.5℃），加热指示灯（绿）应亮，表示正在加热。

c.将CO₂电磁阀开关置于“0”处（关闭电磁阀，因为在未使用CO₂培养箱时CO₂气体也未接通，电磁阀长期通电会发烫，影响其使用寿命），随后将CO₂浓度设定为“0.0”。

d.待温度达到设定值后，将CO₂钢瓶开启（开启前，减压阀应尽量拧松，防止减压阀输出压力过高导致输气管爆裂），减压阀上进气压力表指示钢瓶内CO₂压力，缓慢地顺时针拧减压阀旋钮，使减压阀输出压力指示为0.05MPa，指针处于刻线区中间。此时设定所需CO₂浓度（出厂时调整为0%），开启CO₂进气开关，置于“1”处，即有CO₂进入室内。随着浓度升高，LED显示出CO₂浓度值，到设定值时电磁阀动作，切换到空气及CO₂补气。此时空气流量计浮子应指示在760mL／min（出厂时已调好），CO₂流量计浮子应指示在40mL／min（出厂时已调好）；若浮子偏离上述数值，可用调节针阀细调到760mL／min（空气）及40mL／min（CO₂）（在培养箱门打开后快速恢复时，空气无流量，二氧化碳显示值变化，这是正常现象）。

e.出厂时流量计指示一般调整为5%±0.3%CO₂浓度。

f.当温度达到设定值，波动在±0.5℃以内，CO₂浓度也达到要求后，即可进行细胞培养。放入水盘，自然蒸发湿度一般可达95%，符合要求。

g.在首次使用或停用较长一段时期后再使用，均应按上述要求操作，并且在正式培养前应作箱内污染检查。

⑤关机。关机前应将CO₂钢瓶关闭，将CO₂进气开关置于“1”处，然后切断电源。若较长时间不用，则应将水盘取出，将箱内擦干，放尽水箱里的水。在CO₂开关置于“0”状态下，箱温在37℃下通电2h保证箱内干燥后，切断电源。

图1-19　电热干燥箱

3.电热干燥箱

电热干燥箱（图1-19）主要用于烘干消毒玻璃器皿，也可用于干热消毒。在用于干热消毒时，一般要求温度达到160℃（灭菌）或180℃（去除热原），消毒时间须在2h以上。细胞培养实验室常用的干燥箱为鼓风式电热干燥箱（规格为560mm×500mm×500mm），虽然升温较慢，但温度均匀，效果较好。鼓风与升温同时开始，待温度达到100℃后再关闭，以免玻璃器皿突然遇冷而炸裂。金属解剖器械、塑料制品、橡胶制品等不能放在干燥箱内灭菌。

使用方法：①将待灭菌物品包扎好后放入箱内，关好箱门；②接通电源；③将温度调节器调至160℃，启动鼓风机，以使鼓风和升温同时进行，待温度升至100℃时，停止鼓风，继续升温，待温度升至160℃后需维持2～3h，灭菌结束后，等箱内温度自然下降至60℃以下时，方可开箱取出已灭菌物品。

注意事项：①该设备属大功率高温设备，使用时要注意安全，防止火灾、触电及烫伤等事故；②严禁用来干燥易燃、易爆及酸性物品，样品放置时不能堵塞风道及排气孔，干燥时应逐步缓慢升温；③干燥箱附近严禁放置易燃、易爆物品（如有机溶剂、高压气瓶等）、酸性及腐蚀性物品；④使用时温度不得超过额定温度，以免损坏加热元件；⑤经常清除箱内残留物，保持干燥箱清洁；⑥定期检查电路系统是否连接良好。

4.离心机

一般细胞培养实验室应配有普通离心机（低速离心机，如图1-20所示），最好配置高速冷冻离心机（图1-21）。普通离心机转速在4000r／min以下，台式的就可满足要求，主要用于制备细胞悬液、漂洗、分离细胞。

使用方法（以TGL-16G离心机为例）如下。

（1）接通电源。首先检查离心机是否放置在坚固的实验台面上，然后将三芯插头插入电源插座，将仪器背面左下角的电源开关置于“开”的位置，此时仪表出现数字显示，表示设备进入工作状态。

图1-20　低速离心机

图1-21　高速冷冻离心机

（2）参数设置。离心机的参数设置主要是指转速、离心时间和温度的设置。

①转速设置。在微电脑控制界面按“选择”键，使光标移动到“转速”下的“设置”处，然后按左右移位键，使设定区灯光呈闪烁状，通过上下移位键进行设定，最后按“参数确认”按钮，将设定值保存下来。

②离心时间设置。在微电脑控制界面按“选择”键，使光标移动到“时间”下的“设置”处，然后按左右移位键，使设定区灯光呈闪烁状，通过上下移位键进行设定，最后按“参数确认”按钮，将设定值保存下来。

③温度设置。按控制界面右下角的“制冷”键，通过按动“温度设定”键使光标分别移动到“温度”下的“上限”和“下限”处，然后按左右移位键，使设定区灯光呈闪烁状，通过上下移位键进行设定，最后按“参数确认”按钮，将设定值保存下来。

注意事项：①在离心机中放置离心管时，最好养成总是用同一种方式放置的习惯，如按一定顺序将离心管的塑料柄朝外，这样沉淀总是聚焦在离转头中心最远的离心管内壁；②放置离心管时，一定要注意对称地放入，同时一定要将离心管的管盖盖紧，以防管内液体溅出；③离心结束后，不要人为强制离心机的转头停止转动。

5.水纯化装置

（1）纯水机。纯水机（图1-22）也是细胞培养实验室不可缺少的设备。因为体外培养的细胞对水的要求较高，无论是细胞培养液还是其他各类培养用液等，都应使用蒸馏两次以上的重蒸水（新鲜三蒸水）。

注意事项（以UPW-30S型超纯水器为例）：①仪器的使用水为已经过初次净化的蒸馏水，切不可用自来水；②仪器的进水管管口不能脱离蒸馏水水面，以免空气进入仪器内，影响正常出水；③待显示屏显示值达18.2时，出水方可使用；④超纯水一般现用现取，不要使用存放数日的水。

（2）蒸馏水器。

图1-23所示为三重蒸水器。

注意事项：①使用时应先开启冷却水水源；②要调节去离子水或蒸馏水流速，使之进入一次横式烧瓶的速度基本上与二次横式烧瓶的蒸馏水流出速度相等，使横式烧瓶内的水位达到二分之一；③停用时应先关闭去离子水，再关闭电源，最后关闭冷却水。

图1-22　实验室用纯水机

图1-23　三重蒸水器

6.高压蒸汽灭菌器

高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽，待蒸汽急剧地将锅内的冷空气从放气阀中驱尽，然后关闭放气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能逸出，增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，温度高于100℃，使菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。全自动电热压力蒸汽灭菌锅如图1-24所示。

使用方法（以全自动电热压力蒸汽灭菌锅为例）如下。

（1）堆放。将密封手轮向左旋转，推开锅盖，把待灭菌物品妥善包扎，码放在灭菌桶内的筛板上，在码放灭菌包时应注意在安全阀、放气阀的位置必须留出空位，保障气体排放畅通。

图1-24　全自动电热压力蒸汽灭菌锅

（2）加水。接上与灭菌锅要求一致的电源，将控制面板上的电源开关按至“ON”处，此时断水灯（HL，红灯）亮，显示电源已正常输入。低水位灯（OVT，黄灯）亮，显示蒸发锅内处于断水状态，把水从灭菌桶与蒸发锅夹缝加入，当水位达到低水位时，控制面板上低水位灯和断水灯同时熄灭。此时，应继续加水，到高水位灯（HH，绿灯）亮时，停止加水。

（3）参数设置。加水程序完成后，数显窗内数显均处于亮状态，红色数显为灭菌桶内温度，绿色数显为设定温度。按动控制面板上增加键或减少键，可在绿色数显上设定所需温度，按动移位键，可将闪烁的绿灯数显进行移位设定，当每次设定所需温度结束时，须按一下确认键进行确认，即可完成设定。此时红色数显随着加热器工作蒸发锅内温度上升而变化。温度设定完毕后，将移位键按一下，可切换到时间状态，设定时间。

（4）密封。码放与开机程序完成后，将压板推入固定柱内，应注意压板必须全部推到固定柱内，然后将手轮向右旋紧，使锅盖与主体密封。

（5）灭菌。当按设定的温度与时间灭菌完成时，电控装置自动关闭加热电源，并伴有蜂鸣提醒。关闭电源开关。

由于对灭菌结果要求较高，因此在使用高压蒸汽灭菌锅时要注意以下几个方面。

（1）无菌包不宜过大（小于50cm×30cm×30cm），不宜过紧，各包裹间要有间隙，使蒸汽能对流，易渗透到包裹中央，保证安全阀、放气阀不堵塞，有利于蒸汽流通，而且排气时使蒸汽能迅速排出，以保持物品干燥。消毒灭菌完毕后，关闭贮槽或桶的通气孔，以保持物品的无菌状态。

（2）布类物品应放在金属类物品上，否则蒸汽遇冷凝结成水珠，使包布受潮，阻碍蒸汽进入包裹中央，严重影响灭菌效果。

（3）定期检查灭菌效果。经高压蒸汽灭菌的无菌包、无菌容器有效期以1周为宜。

（4）液体灭菌时，应将液体灌装于硬质耐热玻璃容器中，以不超过容器总体积的3／4为宜，瓶口选用棉花塞、纱塞或于瓶塞与瓶体间夹一定厚度的干净滤纸。灭菌结束时不准立即释放蒸汽，必须待压力表指针回零位方可排放余气。

（5）对不同类型、不同灭菌要求的物品，如敷料和液体等，切勿放在一起灭菌。

（6）灭菌结束时，若压力表指针已回复零位，而盖子无法开启，则可将放气阀置于放气状态，使外界空气进入灭菌锅内，消除锅内真空，盖子即可开启。

（7）压力表使用日久后，压力指示不正确或不能回复零位时，应及时予以检修，平时应定期与标准压力表相对照，若不正常，应更换新表。

（8）平时应保持设备清洁和干燥，方可延长设备使用年限，橡胶密封垫使用日久会老化，应定期更换。

（9）应定期检查安全阀的可靠性。

7.倒置显微镜

细胞培养实验室应配备普通显微镜和倒置显微镜（图1-25）。前者用于细胞计数和一般观察，后者用于观察细胞的生长情况和有无污染。若条件许可，应配置照相系统和荧光显微镜。

图1-25　倒置显微镜

倒置显微镜的使用方法如下。

（1）拨动旋转电位器拨盘，使其处于亮度最低位置，打开仪器电源开关，然后调节电位器使亮度适中。

（2）安放试样或标本。

①将所选定的切片板或培养皿板等放入移动尺的载物片框内，注意一定要放置到位，否则影响观察效果。

②将要观察的试样放置在载物片上的合适位置。

（3）转动物镜转换器（手握转换器外圆的齿纹部分），将低倍物镜置入光路，慢慢转动粗调手轮，用左眼从左固定筒目镜观察，见物像大致轮廓后用微调手轮将像调清晰。然后将高倍物镜置入光路。

（4）双目瞳距调整及视度调节。

①瞳距调整。

瞳距（眼距）因人而异，一般来说，中国人的瞳距比西方人的瞳距大，使用双目显微镜前需调整瞳距。

双手分别握住左右支架转动，直至双目中看到的光环完全重合，此时瞳距即已调好。

②视度调节。

双目观察调焦时，应先以固定筒一侧观察，即左眼从左筒观察，物像调清晰后再从右筒观察，同时调节右筒上的视度调节圈以补偿双目视度上的差异，使两筒成像同样清晰。

（5）孔径光阑调整。

拨动聚光镜孔径光阑拨杆即可改变孔径光阑的大小，从而改变被观察标本、试样的衬度。

取下目镜，直接从目镜筒观察，调整孔径光阑的大小，使其像充满物镜出瞳直径的70%～80%，即可获得衬度较为良好的图像。

（6）滤色片使用。

先根据需要选择好合适的滤色片，取下滤色片座，将滤色片装入其中，再插入灯源，组上即可。

（7）相衬观察。

将与所用相衬物镜相同倍率的环板推入光路，同时将孔径光阑拨至最大，即可进行相衬观察。

（8）粗调限位装置。

倒置显微镜的限位装置也称快速对焦装置。如用10×物镜调焦清晰后，旋紧仪器左侧限位手柄，物镜、转换器上升位置即被限定。在以后的使用中，旋转粗调手轮上升至该定位位置即可见物像轮廓。

（9）松紧调节手轮。

仪器长期使用后可能出现载物平台自动下滑的现象。松紧调节圈可以调节粗微动的松紧，以防止载物台自行下滑，同时调节粗微动操作上的舒适感。顺时针旋转，可以放松；反之，可以锁紧。

8.相差显微镜

利用光的衍射和干涉现象将透过标本的光线光程差或相位差转换成肉眼可分辨的振幅差的显微镜称为相差显微镜。相差显微镜提高了不同密度物质图像的明暗区别，可用于观察未经染色的细胞结构。图1-26所示为倒置相差显微镜。

相差显微镜是荷兰科学家Zernike于1935年发明的，用于观察未染色的标本。活细胞和未染色的生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化（振幅差），这种振幅差人眼无法观察。而相差显微镜通过改变这种相位差，并利用光的衍射和干涉现象，把相位差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。

图1-26　倒置相差显微镜

相差装置为多功能系列显微镜中的附属装置，与普通显微镜配合使用。下面介绍相差显微镜的使用方法。

（1）相差装置的调换安装。

卸下普通显微镜使用的聚光器，将环状光阑装在聚光器支架上，把绿色滤色片放在上面，它可吸收红色和蓝色光，让波长范围小的单色光线透过进行照明，并有吸热作用，能使相差观察获得良好的效果。再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。

（2）调焦。

打开光源，旋转集光器转盘，将“O”对准标示孔，使普通聚光器部分进入光路。先使用低倍相差物镜，按普通显微镜操作方法进行对光和调焦，再旋转环状光阑，使光阑的直径和孔宽与所使用的相差物镜相适应，如相差物镜为40×时应用×40标示孔的光阑。

（3）合轴调整。

拔出目镜，插入合轴望远镜，一边从望远镜内观察，并用左手固定其外筒；一边用右手转动望远镜内筒使其下降，当对准焦点时就能看到环状光阑的亮环和相板的黑环，此时可将望远镜固定住。再升降集光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与黑环一致，然后左右前后调节环状光阑聚光器上的调节钮，使两环完全重合，如亮环比黑环小而位于内侧，应降低集光器，使亮环放大；反之，则应升高聚光器，使亮环缩小。如升到最高限度仍不能完全重合，则可能是载玻片过厚之故，应更换载玻片。合轴调整完毕，抽出望远镜，换回目镜，按常规要领进行观察。在更换不同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹配的环状光阑并重新进行合轴调整。使用油镜时，集光器上透镜表面与载玻片之间要同时加上香柏油。

（4）观察。

在相差显微镜下观察活细胞，可清楚地分辨细胞的形态，细胞核、核仁以及细胞质中存在的颗粒状结构。

操作步骤：①根据所观察标本的性质及要求，挑选合适的相差物镜；②将标本片放到载物台上；③进行光轴中心的调整；④取下一侧目镜，换上合轴调节望远镜，调整环状光阑使之与相板上的共轭面圆环完全重叠吻合，然后取下合轴调节望远镜，换回目镜，在使用中，如需要更换物镜倍数，必须重新进行环状光阑与相板共轭面圆环吻合的调整；⑤放上绿色滤色片，即可进行镜检，镜检操作与普通光学显微镜的方法相同。

注意事项：①视场光阑与聚光器的孔径光阑必须全部开大，而且光源要强，因为环状光阑遮掉大部分光，物镜相板上共轭面又吸收大部分光；②不同型号的光学部件不能互换使用；③载玻片、盖玻片的厚度应符合标准，不能过薄或过厚；④切片不能太厚，一般以5～10μm为宜，否则会引起其他光学现象，影响成像质量。

9.冰箱

细胞培养实验室一般配备有各种规格的冰箱（图1-27），如4℃冰箱、-20℃冰箱、-40℃冰箱、-80℃冰箱。冷藏箱主要用于储存培养液、生理盐水、Hank′s液、试剂等培养用的物品和短期保存的组织标本；冷冻箱用于保存需较长时间存放的制剂，如酶、血清和组织标本或细胞等。冰箱应保持清洁和通风，以防止污染。冰箱内禁止存放有毒、易燃、易挥发物品。

图1-27　冰箱

注意事项：①原则上每位实验操作者的东西均需单独放置；②放置于低温环境下的实验材料最好避免反复冻熔；③需冷冻的实验材料一定要在标签上标明材料所有者、材料名称、制作时间、是否使用；④冰箱内不得存放易挥发、易燃烧的、对细胞有害的物质；⑤-80℃冰箱需专人管理。

图1-28　液氮容器

10.细胞冷冻储存器

细胞冷冻储存器主要是液氮容器（图1-28），容积大小根据实验室需求选定。液氮罐有不同的类型及多种规格，常用的有窄瓶颈和宽瓶颈两类，体积从25L到500L不等。

使用液氮罐时一定要注意，液氮溅到皮肤上能引起冻伤。

11.过滤装置

凡在高温或射线下易发生变性或失去功能的物质，如人工合成培养液、血清、消化用胰蛋白酶等都须用滤器过滤除菌。

现市场上销售的滤器多种多样，主要有Zeiss滤器、玻璃滤器以及微孔滤膜滤器等。滤器中的滤膜一般用0.2～0.3μm孔径的微孔滤膜。其中Zeiss滤器是一种加压式滤器，滤板是由石棉制成的一次性纤维板，可承受一定压力，是过滤血清较理想的滤器，其除菌效果好，但因孔径较小，过滤速度稍慢。

微孔滤膜滤器可分为加压式和抽滤式两种，其中加压式效果更佳。微孔滤膜滤器结构类似于Zeiss滤器，但滤膜不同，微孔滤膜滤器的滤膜为一次性混合纤维素酯，滤膜孔径的大小决定过滤效果的好坏，最常见的有0.6μm、0.45μm、0.22μm三种孔径，为彻底除净细菌和霉菌，最好选用0.22μm孔径的滤膜。这种滤器可用于包括血清在内的各种培养液体的过滤除菌，其过滤速度快，过滤效果好。

图1-29所示为正压式除菌金属滤器，图1-30所示为免压式玻璃滤器，图1-31所示为正压式一次性针头滤器。

图1-29　金属滤器

图1-30　玻璃滤器

图1-31　一次性针头滤器

12.生物反应器

动物细胞培养技术能否工业化、商业化，关键在于能否设计出合适的生物反应器（bioreactor）。由于动物细胞与微生物细胞有很大差异，传统的微生物反应器不适用于动物细胞的大规模培养。动物细胞生物反应器首先必须满足在低剪切力及良好的混合状态下，提供充足的氧以供细胞生长及进行产物的合成。

（1）生物反应器的分类。

目前，动物细胞培养用生物反应器主要包括转瓶培养器（图1-32）、塑料袋增殖器、固化床生物反应器、多层板生物反应器、螺旋膜生物反应器、管式螺旋生物反应器、陶质矩形通道蜂窝状生物反应器、流化床生物反应器、中空纤维及其他膜式生物反应器、搅拌生物反应器、气升式生物反应器、鼓泡式生物反应器等。

按其培养细胞方式的不同，这些生物反应器可分为以下三类。

①悬浮培养用生物反应器，如搅拌生物反应器、气升式生物反应器。

②贴壁培养用生物反应器，如搅拌生物反应器（微载体培养）、玻璃珠床生物反应器。

③包埋培养用生物反应器，如流化床生物反应器、固化床生物反应器。

（2）常见生物反应器的介绍。

①搅拌生物反应器。

搅拌生物反应器如图1-33所示，这是最经典、最早被采用的一种生物反应器。此类生物反应器与传统的微生物反应器类似，针对动物细胞培养的特点，采用了不同的搅拌器及通气方式。搅拌器的作用是使细胞和养分在培养液中均匀分布，使养分能充分被细胞利用，增大气液接触面，有利于氧的传递。现已开发的有笼式通气搅拌器、双层笼式通气搅拌器、桨式搅拌器、海船式搅拌器等。

图1-32　转瓶培养器

图1-33　搅拌生物反应器

②气升式生物反应器。

1979年首次应用气升式生物反应器（图1-34）成功地进行了动物细胞的悬浮培养。气升式生物反应器的优点：a.罐内液体流动温和均匀，产生剪切力小，对细胞损伤较小；b.可直接喷射空气供氧，因而氧传递效率较高；c.液体循环量大，细胞和养分都能均匀分布于培养液中；d.结构简单，有利于密封并降低了造价。

常用的气升式反应器有三种：内循环式气升式生物反应器、外循环式气升式生物反应器、内外循环式气升式生物反应器。

图1-34　气升式生物反应器

③鼓泡式生物反应器。

鼓泡式生物反应器与气升式生物反应器相类似，利用气体鼓泡来进行供氧及混合，其设计原理与气升式生物反应器的设计原理也相同。

④中空纤维生物反应器。

中空纤维生物反应器用途较广，既可用于悬浮细胞的培养，又可用于贴壁细胞的培养。

工作原理：模拟细胞在体内生长的三维状态，利用反应器内数千根中空纤维的纵向布置，提供近似于生理条件的体外生长微环境，使细胞不断生长。中空纤维是一种细微的管状结构，管壁为极薄的半透膜，富含毛细管，培养时纤维管内灌流富含氧气的无血清培养液，管外壁则供细胞黏附生长，营养物质通过半透膜从管内渗透出来供细胞利用；血清等大分子营养物必须从管外灌入，否则会被半透膜阻隔不能被细胞利用；细胞的代谢废物也可通过半透膜渗入管内，避免了代谢产物累积对细胞的毒害作用。

设备优点：a.占地空间少；b.细胞产量高，细胞密度可达10⁹数量级；c.生产成本低，且细胞培养维持时间长，适用于长期分泌的细胞。

三、细胞培养实验室器材

常用的细胞培养器皿有培养瓶、培养板、培养皿等。培养用器皿应采用透明度好、无毒、利于细胞黏附和生长的材料，常用的培养器皿为一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。玻璃培养器皿透明度好，由无毒的中性硬质玻璃制成，能消毒，可反复使用，便于观察结果，但易碎，清洗麻烦。塑料制培养器皿无毒、光滑且透明，出厂时已经消毒处理，拆开包装即可使用，用后废弃便可，但费用高，浪费大。

图1-35　培养皿

1.培养皿

培养皿如图1-35所示。

作用：盛放、分离、处理组织，细胞毒性检测、集落形成、单细胞分离、同位素掺入、细胞繁殖等。

规格：10cm、9cm、6cm、3.5cm等。

2.细胞培养瓶

不同种类的细胞培养要求使用不同规格的细胞培养瓶（图1-36），细胞传代培养要求培养瓶壁薄厚均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位。常用的规格有200mL、100mL、50mL、25mL、10mL等几种。用于外周血细胞培养的为普通圆瓶，常见规格为10mL。细胞培养瓶均要求选用优质玻璃制成。

图1-36　细胞培养瓶

3.多孔培养板

多孔培养板如图1-37所示。

图1-37　多孔培养板

作用：细胞培养、细胞理化性质检测、细胞毒性检测等。

规格：4孔、6孔、12孔、24孔、48孔、96孔。

优点：可同时进行大量样品的培养，由于培养室相对独立、窄小，在一定程度上可节省实验样品和实验试剂。

4.移液器

移液器（图1-38）主要用于吸取、移动液体或滴加样本，可根据需要调节量的大小，吸量准确、方便。尤其是微量移液器，可保证实验样品（或试剂）含量精确，重复性良好。

图1-38　移液器

（1）常用移液器的规格。微量移液器有多种规格，在移液器量程范围内能连续调节读数。移液器常见的四种规格分别是0.5～10μL（读数窗显示0.5～10.0，每转1挡为0.1μL）、10～100μL（读数窗显示10.0～100，每转1挡为1μL）、20～200μL（读数窗显示20.0～200，每转1挡为1μL）、100～1000μL（读数窗显示100～1000，每转1挡为5μL）。

移液器的枪头如图1-39所示。

（2）使用方法：①将微量移液器装上枪头（不同规格的移液器用不同的枪头）；②将微量移液器按钮轻轻压至第一停点；③垂直握持微量移液器，使枪头浸入液面下几毫米，千万不要将枪头直接插到液体底部；④缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样液，否则液体进入吸嘴太快，会导致液体倒吸入移液器内部，或吸入体积减小；⑤等1s后将吸嘴提离液面；⑥平稳地把按钮压到第一停点，再把按钮压至第二停点以排出剩余液体；⑦提起微量移液器，然后按退枪头钮到底，将枪头弹出。

（3）移液器使用注意事项：①改变移液量程时应从大调到小，由小值调到大值时应先多调1／3圈再反调至设定值；②更换的新枪头尖应进行预洗，吸取有机溶液时最好预洗2～3次；③操作移液器要平稳、缓慢，释放按钮时不可过快，以免将液体吸入吸液杆内；④枪头内尚存液体时切勿将移液器平放或倒置，以防止液体流进吸液杆内；⑤吸取了强酸或其他腐蚀性溶液后，应将移液器拆开，用蒸馏水清洗活塞和密封圈，完全干燥后再组装；⑥若刻度与实际取液量相差甚大，可以用精密天平检测其精度，若精度差别很大，则应送专业维修点进行维修；⑦微量移液器有不同的移液范围，超过其量程易损坏其精度，而且不能再回到原来位置，对此应特别注意；⑧漏液可能是微量移液器内部润滑油已耗尽，或吸液杆头部破损所致，自己可以修复。

图1-39　枪头

（4）移液器枪头使用注意事项：①移液器枪头在出厂前已经进行过消毒处理，平时不用时请不能随便将其包装袋打开；②各规格的枪头要在无菌的条件下分装到枪头盒内再次进行高温灭菌处理，灭菌后的枪头一定要注意规范使用，以防二次污染；③枪头盒需定期进行清洗，清洗方法为洗衣粉水刷洗→自来水冲净→蒸馏水冲洗3次→超纯水冲洗3次。

5.试剂瓶

试剂瓶用于储存各种配制好的培养用液、血清等液体，常用规格有500mL、250mL、100mL、50mL等几种，常以生理盐水瓶或血浆瓶代替。

6.其他

在细胞培养实验室还需配备足够量的烧杯、能灭菌处理的药匙、容量瓶以及移液管等常规器材。

知识拓展

洁净室（区）的空气洁净度标准

细胞培养室可参照洁净室（区）的空气洁净度标准进行设计。空气洁净度是洁净环境中空气含悬浮粒子多少的程度。通常空气中含尘浓度低则空气洁净度高，含尘浓度高则空气洁净度低。按空气中悬浮粒子浓度来划分，洁净室及相关受控环境中空气洁净度等级就是以每立方米空气中的最大允许粒子数来确定的。一般来说，万级或十万级洁净度的环境都可以认为是洁净度级别比较高的环境，但进行细胞培养无菌操作时还需要在超净工作台内进行，超净工作台内的洁净度是百级。中国药品生产洁净室（区）的空气洁净度标准如表1-4所示。

表1-4　中国药品生产洁净室（区）的空气洁净度标准