实验操作技术

1．生化实验的基本操作技术

（1）玻璃仪器的洗涤和干燥：各种玻璃仪器的清洁程度直接影响实验结果的准确性。应根据实验要求、污物性质和玷污程度选用合适的清洁方法。非定量敞口玻璃仪器，如试管、离心管、烧杯等，均可直接用毛刷蘸洗涤灵或洗衣粉刷洗，然后用自来水反复冲洗干净，最后用少量蒸馏水洗3遍。定量玻璃仪器，如滴管，吸量管等，先用自来水冲洗晾干，然后于洗液中浸泡数小时，取出待沥净洗液后，用自来水充分冲洗，最后用蒸馏水冲洗2～3遍。比色杯用毕立即用蒸馏水反复冲洗，避免用碱液或强氧化剂清洗，切不可用试管刷或粗糙布（纸）擦拭。玻璃仪器洗净后，以倒置后内壁不挂水珠为清洁的标准。

5%铬酸洗液的配制：称取K2Cr2O75g，置于200ml烧杯中，加蒸馏水5ml，使其尽量溶解，缓慢加入浓硫酸100ml边加边搅拌，待冷却后使用。铬酸洗液一般呈棕色黏稠溶液，遇有机溶剂或水过多时变为绿色。

洗液使用注意事项：洗液是强氧化剂，有很强的腐蚀性，使用时注意不要滴溅到衣物及实验台等处，拿取洗液中的玻璃仪器时，需戴防酸手套，切忌用手直接拿，如不小心溅到皮肤上，立即用大量清水冲洗。

玻璃仪器的干燥方法可根据不同仪器的种类而定。一般地说洗净后的玻璃仪器，如不急用应倒放在晾架上令其自然干燥。若有急用可放在烘箱中烤干，但容量玻璃仪器，如容量瓶、吸量管、滴定管以及烧杯、结构复杂的玻璃仪器等，严禁烘烤。此类仪器，如急用可采用水泵抽气法干燥。

（2）液体的定量转移

吸量管的使用：常用的玻璃吸量管有三类：①奥氏吸量管：中下部有一呈橄榄型的膨大，适用于量取黏度较大的溶液。②移液管：中部膨大处呈圆筒状。此类吸量管目前不常用。③刻度吸量管：每根吸量管上有许多等分的刻度，刻度标记有自上而下和自下而上两种，规格为0．1ml，0．2ml，0．5ml，lml，2ml，5ml，l0ml等。

吸量管的选取原则：在一次完成移液的前提下，应选用容量较小的吸量管，对于同一次实验中同一种试剂的移取，应选用同一支吸量管。

刻度吸量管的操作：①执管：拇指和中指（辅以环指）执吸量管上部，使吸量管保持垂直，示指按住管上口调节流速，刻度朝向操作者。②取液：把吸量管插入液体，用洗耳球吸取液体至所需量取刻度上方2～3cm，移开洗耳球，迅速用示指压紧管口，然后抽离液面（必要时用滤纸片将管尖端外围拭净）。③调准刻度：用示指控制液体至所需刻度（此时液体凹面、视线和刻度应在同一水平线上）。④放液：移开示指，让液体自然流入容器内。此时，管尖应接触容器内壁，但不应插入容器的原有液体中（否则管尖会沾上容器内试剂，再移液时致使试剂交叉污染）。待液体流尽，将最后液滴吹出或转动吸量管使其沿容器内壁流出。⑤洗涤：吸取血浆、尿及黏稠试剂的吸量管，用后应及时用自来水冲洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管，可待实验完毕后再洗。

可调式移液器的使用：可调式移液器可用来量取μl级别的液体，操作简单，规格有10μl、20μl、50μl、100μl、200μl、1　000μl等。

（3）液体的混匀：样品和试剂的混匀是保证化学反应充分进行的一种有效措施。为使反应体系内各物质迅速地接触，必须借助于外力的机械作用。常用的混匀方法有以下几种：①旋转法：手持容器，使溶液作离心旋转。适用于未盛满液体的试管或小口器皿如锥形瓶。②指弹法：一手执试管上端，另一只手轻弹试管下部，使管内溶液作旋涡运动。③搅动法：使用干玻璃棒搅匀，多用于溶解烧杯中的固体。④混匀器法：将容器置于混匀器的振动盘上，逐渐用力下压，使内容物旋转。⑤颠倒法：当容器口细、液体量较多时，可用瓶盖把口盖住，颠倒数次使液体混匀。如无瓶盖可用拇指或手掌按紧管口，颠倒数次，使液体混匀。

（4）恒温技术：将容器放入恒温水浴箱，调节温度设定钮至所需温度。水浴箱中水分要充足，实验过程中要随时监测温度，并及时调节。

2．沉淀的分离　生化实验室常用的沉淀分离方法有两种：过滤和离心。

（1）过滤：一般生化实验中，常用过滤法分离沉淀，滤液或沉淀用于各种分析。过滤用优质滤纸和小漏斗进行。先把圆形滤纸对折两次成圆锥体与漏斗内壁靠紧，滤纸与漏斗壁之间无气泡，使过滤速度加快，向滤纸上倾注液体，沿玻璃棒加于中央，加液量不要过多。

（2）离心技术：被分离的液体量过少或黏稠，难以过滤或不适于长时间过滤者，可离心分离。离心法是利用离心力将不同质量的物质进行分离。离心力与转速的平方、物质质量及旋转半径成正比。目前常用的电动离心机转速快，分离效果较好，能迅速地使溶液中的悬浮物沉淀下来，使上清液和沉淀物分离，用于进一步分析。

低速离心机的使用要领主要包括：①离心前检查：取出所有套管，起动空载的离心机，观察是否转动平稳；检查套管有无软垫，是否完好，内部有无异物；离心管与套管是否匹配。②离心原则：一是平衡，将一对离心管放入一对套管中，置于天平两侧，用滴管向较轻一侧的离心管与套管之间滴水至两侧平衡。二是对称，将已平衡好的一对套管置于离心机中的对称位置。③离心操作：对称放置配平后的一对管后，取出多余的套管，盖严离心机盖。调节转速调节钮，逐渐增加转速至所需值，记时。离心完毕后，缓慢将转速调回零。待离心机停稳后取出离心管，并将套管中的水倒净，所有套管放回离心机中。

使用离心机注意事项：①离心机需放在牢固平稳的地面上，保持水平位置。②使用离心机，关键问题是对称位置离心力平衡，不仅对称位置上的总重量相等，而且重心所在位置也应对称，只有这样才能保证仪器正常运转和得到较好的离心效果。③起动和停止都必须逐渐地进行，起动过快，可能有多余电流变为热能，有烧线的危险，振动大，易使液体溅出或打破玻璃管。强制停止，会使沉淀振起来，也会损坏仪器。④起动或离心过程中出现异常响声时，要及时停止转动进行检查。⑤离心过程中勿使液体溅出腐蚀机体，机腔内保持干燥清洁。⑥离心机要经常检查和维修。

3．分光光度分析技术　是生物化学研究领域一项最基本且十分重要的定量分析技术。

（1）分光光度分析技术的基本原理：有色溶液颜色的深浅与其中呈色物质的含量成正比关系。在定量分析中，利用比较有色物质溶液的颜色深浅来测定物质含量的分析方法称为比色法。被测物质中，有的本身就是有色物质，但多数被测物质本身无色或颜色很浅，需加入某些化学试剂使被测物质与之发生反应生成有色的物质。

物质的颜色是由于物质吸收某种波长的光线以后，通过或反射出某种颜色的结果。当一定波长的单色光通过该物质的溶液时，该物质都能有一定程度的吸光作用，单位体积内的溶液中该物质的质点数越多，对光线吸收就越多。因此，利用物质对一定波长光线吸收的程度测定物质含量的方法，称为分光光度法。

分光光度法依据Lambert－Beer定律。设一束单色光I0射入溶液，由于部分光线被溶液吸收，通过的光线为It，则It／I0之比为透光度T（%），即：

透光度（T）的倒数（1／T）反映了物质对光的吸收程度。在实际应用时，取（1／T）的对数值，作为吸光度用A表示，即：

根据Lambert－Beer定律推导，当一束平行单色光通过均匀、无散射现象的溶液时，在单色光强度、溶液温度等条件不变时，溶液对光的吸收度（A）与溶液的浓度（C）及液层厚度（L）的乘积成正比。即：A＝KCL

在实际比色时，标准溶液与被测溶液使用完全相同的比色杯，即液层厚度（L）相同。K为常数，测定同一种物质时，K标＝K测。所以，上述公式即可简化为仅是溶液的光吸收度（A）与其浓度（C）之间的关系。即溶液的浓度越大，吸光度越大。可以通过测定吸光度求知某一溶液的浓度。

设：测定管的吸光度和浓度分别为A测和C测，标准管吸光度和浓度分别为A标和C标，根据A＝KCL得知：A测∶A标＝C测∶C标，则：

上式中C标为已知，A测和A标可在比色时读出数值，把这些数值代入公式，即可求出测定管浓度。

（2）分光光度计的基本结构：分光光度计种类和型号较多，现以721分光光度计为例介绍。721分光光度计为光电管换能、电子放大、指针直读式棱镜分光光度计。仪器的内部包括光路系统和电子电路系统。主要部件有光源灯、单色光器、入射光及出射光调节系统、比色皿座、光电管电子放大器等。仪器的光学系统为棱镜分光器，并采用自准光路以获得单色光束。

测定有色溶液的吸光度时，溶液必须是透明的。入射光的波长应该是溶液对光能有最大吸收的波长，这就要求选用单色光（溶液颜色的互补色），使入射光的光能在通过溶液时被最大限度地吸收，使透过光的光能明显减少。因此，测定时应根据溶液的颜色选用适当波长的光线。分光光度计能提供波长范围极窄接近于单色光的入射光。测定有色溶液时，选用入射光的波长在可见光范围内（波长400～760nm）。

（3）分光光度计的使用要领：以721分光光度计为例，其使用要领包括如下步骤：①接通电源，打开开关，打开比色箱盖；②选择所需波长，选择适宜灵敏度；③转动0旋钮，调T为0；④转动100旋钮，调T为100%，预热20min；⑤预热后，将空白液、标准液、测定液分别倒入3个比色杯中，将比色杯放入比色盒，再将比色盒放入比色箱中，使空白液对准光路，合上比色箱盖；反复几次调节T＝0、T＝100%即开盖调“0”，闭盖调“100”；⑥轻轻拉动比色槽拉杆，先后将标准液、测定液对准光路，分别记录A标数值和A测数值；⑦比色完毕，关闭电源，拔下插头，恢复各旋钮至原来位置，取出比色杯，合上比色箱盖。将比色杯冲洗干净后倒置晾干；⑧计算：根据记录的A测、A标和已知的C标3个数值，按公式算出C测数值。

4．电泳技术　带电粒子在电场中向与其电性相反的方向移动的现象称为电泳（electrophoresis）。1937年Tiselius利用U形玻管进行血清蛋白电泳。电泳后用光学系统使各种蛋白所形成界面折光率差别成为曲线图象，发现血清蛋白质可分为4～5个峰，即清蛋白、α（α1及α2）、β和γ球蛋白。从此，电泳技术开始应用于临床。下面主要介绍常用区带电泳的一般原理和应用。

（1）电泳的基本原理：电泳过程中的动力为电场力F，其大小与粒子所带的电量Q和电场强度E成正比，阻力f可由stoke定律描述，即：

F＝QE f＝6пηrv（注：v为粒子运动速率；r为球形粒子半径；η为介质黏度）

当二者平衡时，粒子在介质中做恒速运动，若将单位场强下粒子的运动速度（v／E）定义为迁移率，以μ表示，则：QE＝6пηrv，μ＝v／E＝Q／6пηr。

可见粒子的迁移率在一定条件下取决于其本身的性质，即电荷、大小和形状。在具体实验中，一定的电压和电泳时间下，迁移率反应为各种粒子在介质中的位移不同。

（2）电泳的影响因素：主要包括①电渗：由于介质吸附水中的H＋或OH－使其表面溶液相对带电。在电场作用下，介质附近的溶液就向正极或负极移动，这种现象称为电渗。电渗与电泳同时存在，其方向可与电泳相同或相反。凝胶的电渗作用很小。②介质的pH：介质的pH影响蛋白质等具有两性解离性质的物质的电离情况，即决定了其带电量Q及电荷的性质。为保持介质pH的稳定，常用一定的缓冲溶液。介质的pH与待电泳物的等电点相差越多，待电泳物所带的电荷越多。③缓冲液的离子强度：常用的离子强度为0．02～0．2之间。离子强度过低，则缓冲液容量小，不易维持介质的pH的稳定；离子强度过高则降低蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。④电场强度：即单位距离的电位差，与电泳的位移成正比。在介质一定时，其取决于电压的大小。电压越高电泳速度越快，但产生热量增加，可致缓冲液蒸发，介质离子强度增加，甚至使蛋白质变性而不能分离。因而在高压电泳时（大于50V／cm）需要加冷却装置。⑤颗粒表面所带电荷的数量：带电荷多者泳动速度较快，反之泳动较慢。⑥带电粒子的大小：血清是多种蛋白质的混合液，具有胶体性质。因其分子量、等电点及分子结构不同，在同一电泳条件下的迁移率也不同，泳动相当时间后，各种血清蛋白质成分就可彼此分开。

（3）电泳的分类：目前所采用的电泳方法，大致可分为三类：显微电泳、自由界面电泳和区带电泳。区带电泳应用较广，可分为以下几种类型：

按支持物的物理性质不同，区带电泳可分为：①纸电泳：滤纸为支持物。②粉末电泳：如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。③凝胶电泳：如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳。④缘线电泳：如尼龙丝、人造丝电泳。

按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为：①平板式电泳：支持物水平放置，是最常用的电泳方式。②垂直板式电泳：支持物垂直放置，聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳。③垂直柱式电泳：聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳即属于此类。④连续液动电泳：首先应用于纸电泳，将滤纸垂直竖立，两边各放一电极，溶液自顶端向下流，与电泳方向垂直，以后有用淀粉、纤维素粉、玻璃粉等代替滤纸分离血清蛋白，分离量较大。

按pH的连续性不同，区带电泳又可分为：①连续pH电泳：即整个电泳过程中pH保持不变，常用的纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳等属于此类。②非连续pH电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同的pH，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白质时常用这种形式，它的优点是在不同pH区之间形成高的电位梯度区，使蛋白质移动加速压缩为一极狭窄的区带达到浓缩的作用。但聚丙烯酰胺凝胶电泳分离核酸时则一般采用连续pH装置。

近年来发明的等电聚焦电泳可称为非连续pH电泳。其基本原理就是在电泳管或电泳支持物中加入两性载体溶液，经电场作用，可以建立从正极到负极逐步增加的pH梯度。当蛋白质样品进入此体系时，各种蛋白质经电泳分别移动或聚焦到其等电点相当的pH位置上，从而能使各种等电点不同的蛋白质分离出来，形成不同的蛋白质区带。

（4）电泳技术的应用：电泳技术主要用于分离各种有机物（如氨基酸、多肽、蛋白质、酶、脂类、核酸等）和无机盐。也可用于分析某种物质纯度，还可用于分子量的测定。电泳技术与其他分离技术（如层析法）结合，可用于蛋白质结构的分析，“指纹法”就是电泳法与层析法的结合产物。用免疫原理测试电泳结果，提高了对蛋白质的鉴别能力。电泳与酶学技术结合发现了同工酶，对于酶的催化和调节功能有了更深入的了解，所以电泳技术是医学科学中的重要研究技术。

5．层析技术　利用混合物各组分物理化学性质（如溶解度、吸附能力、电荷和分子量等）的差别，使各组分在支持物上集中分布在不同区域，借此将各组分分离的方法称为层析。

（1）层析基本原理：层析系统分为两个相，一个称为固定相，另一个称为流动相。由于各组分受固定相的阻力和受流动相的推力影响不同，各组分移动速度也各异，从而使各组分得以分离。此法首先用于有色物质的分离，故又称色层分析法。

（2）层析技术的分类：根据机制的不同，可将层析法分为：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等多种类型。

吸附层析是指某种物质如氧化铝、硅胶等具有吸附其他一些物质的性质，且对各种被吸附物质的吸附能力不同，利用这种差异可将混合物分离。根据操作方式不同，分为柱层析和薄层层析。分配层析是利用混合物在两种或两种以上的不同溶剂中的分配系数不同而使物质分离的方法，相当于一种连续性的溶剂抽提方法。纸层析是最广泛应用的一种分配层析。离子交换层析是利用离子交换剂对需要分离的各种离子有不同的亲和力而达到分离的目的。目前采用的离子交换剂大多是合成离子交换剂，即离子交换树脂，可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。凝胶层析法主要是根据混合物中各种分子的分子量不同，通过固定相凝胶时，分子的扩散移动速度各异使大小不同的分子得以分离和纯化。亲和层析是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术，又称生物专一吸附技术。具有专一性亲和力的成对生物分子主要有酶和底物、特异性抗原和抗体、激素和它的受体等。

（3）层析技术的应用：层析法是近代生物化学最常用的分析法之一，此法可以分离性质极为相似，而用一般化学方法难以分离的各种化合物，如氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。

（赵瑞巧）