切片操作技术

(一)切片机

切片机是制作组织切片的专用设备,能将各种组织块切成薄而均匀、能用显微镜观察的组织薄片。

1.切片机的类型

(1)石蜡切片机:按其结构可分为轮转式、摇动式、滑动式与推动式(雪橇式)等类型。最常用的是轮转式切片机,它借转动手摇轮使夹有包埋组织的蜡块上下移动,同时向切片刀方向推进,进行切片。推进的距离根据要求用刻度调节器调节,切片刀的切制角度也可调整,常规切片厚度为3~5μm。此种切片机机体较重,稳定性好,非常适用于切制石蜡切片,可以理想地连续切片。

(2)冷冻切片机:在主机上带有冷冻装置的切片机都可以成为冷冻切片机,依据是否恒温分为开敞式和恒冷箱式两类。前者将组织块承托台改换成急速冷冻装置(液体CO 2制冷装置或半导体制冷装置),由于温度不易控制,切片技术难度大,切片厚8~15μm,不易连续切片,目前已很少使用;后者将轮转式切片机置于-30℃低温密闭冷冻箱内,利用压缩机通过制冷剂循环制冷,切片时不受外界温度和环境影响,可连续切4~8μm的薄片,是目前主流类型,主要用于手术中快速病理诊断及组织化学、免疫组织化学。

(3)火棉胶切片机:用于火棉胶包埋组织切片的切片机多为滑动式切片机,其特点是固定组织块的夹具不动,通过切片刀的滑动进行切片。多用于脑、眼球、脊髓、内耳等特殊组织的切片,切片厚度为20~50μm。

(4)超薄切片机:是制作供透射电子显微镜用超薄切片的切片机。它可将各种包埋剂包埋的样品用玻璃刀或钻石刀切成50nm以下的超薄切片。超薄切片机有机械推进式和金属热膨胀式两种类型。前者用微动螺旋和微动杠杆来提供微小推进;后者利用金属杆热胀冷缩时产生的微小长度变化提供推进。

2.切片机的维护 切片机是精密仪器,日常必须注意维护和保养(包括不经常使用的切片机),不应随意拆卸零部件以免影响精度,每次使用后要及时打扫、清洁,避免灰尘及有机物污染,应涂抹优质机油防止生锈。

(二)切片操作

1.切片前准备

(1)切片用品准备:①切片刀,事先磨好切片刀或更换好一次性切片刀,检查切片刀是否锋利简便的方法是用一根头发在刀刃上碰一下,如果一碰即断,说明锋利,也可以用显微镜检查刀刃是否平整、有无缺口,不锋利的切片刀会造成蜡片皱缩、卷片、不完整;②足够的载玻片及盖玻片经清洁液、95%乙醇处理后备用,将载玻片与盖玻片放入清洁液时,要一片一片地投入,使其不重叠;③调试好摊片、烤片仪,摊片水温为42~45℃,烤片温度在55℃左右,如无此设备可自制温水浴,用小功率电炉加热搪瓷碗内温水摊片,用恒温箱烤片;④大、中号优质毛笔(用于操作蜡片),记号笔(铅笔或钻石笔,用于在载玻片上写编号)、眼科弯镊子等;⑤配制蛋清甘油,将新鲜鸡蛋清30ml与等量甘油混合,玻璃棒搅匀、粗滤纸或数层纱布过滤至量筒中,放置一昼夜,加入1~2粒麝香草酚结晶防腐。必要时作为粘贴剂均匀涂抹载玻片,以增加其对蜡片的黏附性,防止脱片。

(2)蜡块准备:将蜡块组织面周围多余的石蜡用刀修去,此过程称修蜡或修块。组织块上下边缘及左右两侧的蜡边都要修齐修平;左右两侧的蜡边以2mm为宜,太窄易损坏组织,太宽则影响后续的展片;两侧的蜡边如不平行,切片时会导致蜡带弯曲;组织块上下边缘的石蜡也要尽量少留,以减少连续切片蜡带的组织间距。这样切下的蜡片既呈带状,又不弯曲,在粘片时可以相应多粘,有利于检查诊断;修切蜡块时要仔细少量切掉蜡边,如果大片修切易使蜡块断裂,组织露出,遇此情况应重新包埋;修整好的蜡块用冷水或置入冰箱冷却,以增加硬度,便于切片。

2.切片制作过程

(1)蜡块安装:将修好、冷却的蜡块在切片机固定器上夹紧,调整相关旋钮使蜡块切面与操作台垂直。

(2)切片刀安装:将切片刀安装到切片机刀坐上,调整好角度,刀刃与蜡块夹角一般为5°,固定后移动刀坐使刀刃与蜡块接触。

(3)切修组织块:用较大进刀量(15~20μm)粗切蜡块,直到切出组织最大面,质地较硬的组织或较小的组织应薄一些;小标本,不要切得过多,以免余下组织过少无法再切出可用于诊断的组织片;再将切片厚度调到需要刻度(4~6μm),准备正式切片。

(4)切片:左手持毛笔,右手连续旋转切片机转轮,切出连成带状的蜡片带(即蜡带)。

(5)展片:是指石蜡切片漂浮在温水中,受热后在表面张力的作用下自然平整地展开的过程。右手用眼科弯镊子轻轻夹住蜡带远端,左手用毛笔沿切片刀的刀刃轻轻托起蜡带,正面朝上把蜡片放入50℃水中摊平(展片),水温过高,会引起组织细胞散开;过低,切片皱褶无法摊平。如展片困难,可先将蜡片放入30%乙醇中初展,让乙醇的张力把皱褶展开,但细胞间黏附性小的脂肪类组织一遇乙醇就散开,不能用乙醇初展。

(6)粘片:是指将已经展平的蜡片从温水中捞起、贴附在载玻片上的过程。用镊子轻轻将连续的蜡片分开,选择完整无划痕、厚薄适中、均匀的蜡片,用载玻片捞起。单个切片要贴到载玻片的1/3~2/3;连续切片的粘片顺序一般是从左到右,组织切片较小时(如胃镜标本),可以并列粘2~3条蜡带。粘片后必须立即在载玻片的标签端写上编号。

(7)烤片:粘好的切片室温下稍微干燥后,放到60℃恒温烤箱或烤片仪中烤干,备用。烤片时间一般为30~60min。温度过高、时间过长会引起切片细胞收缩,组织抗原性丢失;相反(少于20min)容易脱片。

(三)注意事项

1.切片机安装放置要求。宜放置在距地面65~80cm高的操作台上,操作台必须平整、稳固,机器底面无杂物,机器的四周要有足够空间给使用者操作。室内应通风、整洁。

2.切片前蜡块要冷冻,以增加硬度利于切片;特别是夏季,气温高,蜡块发软不利切片,一定要冷冻,但刚包埋好的热蜡块不能马上冷冻,否则会使蜡块出现裂痕,一夹就碎。

3.切片刀和蜡块固定要牢固。固定不牢会使切片厚薄不匀,切片上形成横向皱纹;甚至在切片过程中崩裂。但也要避免过分用力夹碎了蜡块。

4.切片刀的倾角以15°~20°为好,切片角度不对,切出的蜡片易皱缩,要慢慢调试,一旦找到最佳切片角度,不要随意改变。操作切片机时用力要均匀、柔和、平稳,避免用力不匀或过重。

5.如遇难切的蜡块,可用与蜡块切面差不多大小的薄纸潮湿后贴在蜡块上切片,然后将附有蜡片的一面朝上放入水中展片。

6.展片用的水要清洁,粘片后水面漂浮的蜡片碎屑要及时清理,以免污染后续切片。

7.在向切片机上夹放蜡块时,组织中难切的部分(如皮肤、肿块的包膜、胃肠道浆膜等)应该朝上放,这样可以减少组织断裂发生。

8.对脱钙组织、骨髓以及已知的钙化组织,应选用固定位置刀口切片,以减少其他位置出现缺口的可能。

9.遇易脱片组织(如血凝块、脑组织)时,可选用蛋白甘油或多聚赖氨酸处理过的载玻片粘片。

10.连续切片放入热水漂片时,不要捞取第一、二张蜡片,因为前两张蜡片较厚,组织往往有空洞(镜下可见)。

(四)石蜡切片中常见问题及对策

见表3-1。

表3-1　石蜡切片中常见问题及对策

(续 表)

注:切制石蜡切片困难最常见原因:一是刀钝或刀刃受损;二是蜡块或切片刀的调整螺旋或紧固螺旋未能拧紧。切片者在开始切片前应习惯性核查