超薄切片机的固定操作

超薄切片术

将小块生物材料，用液态树脂单体浸透和包埋，并固化成塑料块，后用超薄切片机切成厚度为500埃左右，甚至只有50埃的超薄切片。超薄切片的制备程序与光学显微镜的切片程序类似，但各步骤的要求以及所使用的试剂和操作方法有很大差别。

固定

选用适宜的物理或化学的方法迅速杀死组织和细胞，力求保持组织和细胞的正常结构，并使其中各种物质的变化尽可能减小。固定能提高细胞承受包埋、切片、染色以及电子束轰击的能力。主要固定方法有：

1．快速冷冻，用致冷剂（如液氮、液体氟利昂、液体丙烷等）或其他方法使生物材料急剧冷冻，使组织和细胞中的水只能冻结成体积极小的冰晶甚至无定形的冰——玻璃态。这样，细胞结构不致被冰晶破坏，生物大分子可保持天然构型，酶及抗原等能保存其生物活性，可溶性化学成分（如小分子有机物和无机离子）也不致流失或移位。用冷冻的组织块，可进行切片、冷冻断裂、冷冻干燥和冷冻置换等处理。用此法固定的样品既可提供组织、细胞结构的形态学信息，又可提供相关的细胞化学信息。

2．化学固定，固定剂有凝聚型和非凝聚型两种，前者如光学显微术中常用的乙醇、二氯化汞等，此法常使大多数蛋白质凝聚成固体，结构发生重大变化，常导致细胞的细微结构出现畸变。非凝聚型固定剂包括戊二醛、丙烯醛和甲醛等醛类固定剂和四氧化钅我，四氧化钼等，适用于电子显微。它们对蛋白质有较强的交联作用，可以稳定大部分蛋白质而不使之凝聚，避免了过分的结构畸变。它们与细胞蛋白质有较强的化学亲和力，固定处理后，固定剂成为被固定的蛋白质的一部分。如用含有重金属元素的固定剂四氧化钅我（也是良好的电子染色剂）进行固定，因为钅我与蛋白质结合，增强了散射电子的能力，提高了细胞结构的反差。采用一种以上固定剂的多重固定方法，如采用戊二醛和四氧化钅我的双固定法，能较有效地减少细胞成分的损失。此外，固定剂溶液的浓度、pH及所用的缓冲剂类型、渗透压、固定时间和温度等对固定效果都有不同程度的影响。

固定操作方法通常是先将材料切成1立方毫米左右小块，浸在固定液中，保持一定温度（通常为4℃），进行一定时间的固定反应。取材操作要以尽可能快的速度进行，以减少组织自溶作用造成的结构破坏。对某些难以固定的特殊组织，如脑、脊髓等，最好使用血管灌注方法固定，即通过血管向组织内灌注固定液，使固定液在组织发生缺氧症或解剖造成损伤之前，快速而均匀地渗透到组织的所有部分。灌注固定的效果比浸没固定好得多。

脱水

化学固定后，将材料浸于乙醇、丙酮等有机溶剂中以除去组织的游离水。为避免组织收缩，所用溶剂需从低浓度逐步提高到纯有机溶剂，逐级脱水。

浸透

脱水之后，用适当的树脂单体与硬化剂的混合物即包埋剂，逐步替换组织块中的脱水剂，直至树脂均匀地浸透到细胞结构的一切空隙中。

包埋

浸透之后，将组织块放于模具中，注入树脂单体与硬化剂等混合物，通过加热等方法使树脂聚合成坚硬的固体。用作包埋剂的树脂有甲基丙烯酸酯、聚酯和环氧树脂等。最广泛使用的是某些类型的环氧树脂，如618树脂、Epon812、Araldite和Spurr等商品树脂。它们具有良好的维持样品特性、低收缩率和较强的耐电子轰击能力等优点。

切片

制备超薄切片要使用特制超薄切片机（大多是根据精密机械推进或金属热膨胀推进原理制成）和特殊的切片刀（用断裂的玻璃板制成的玻璃刀或用天然金刚石研磨而成的金刚石刀）。先将树脂包埋块中含有生物材料的部分，用刀片在立体显微镜下修整成细小的金字塔形，再用超薄切片机切成厚度适中（500埃左右）的超薄片，切片应依次相互联接形成切片带。切片带漂浮于装在切片机上的水槽中的水面上。

通过装置在切片机上的解剖显微镜，监控切片过程。用荧光灯照射水面上的切片，并根据由此产生的干涉光颜色来判断切片的实际厚度。

切片通常用敷有薄的支持膜的特制金属载网，从水面上捞取。快速冷冻固定的生物材料，可用冷冻超薄切片装置制成切片。用醛类或冷冻方法固定的组织，可通过超薄切片术与生物化学技术、免疫技术等结合使用，进行超微结构水平上的蛋白质、核酸、酶及抗原等生物活性物质的定位甚至定量研究。这就是电镜细胞化学技术和电镜免疫细胞化学技术。

染色

电子显微镜主要是依赖散射电子成像，为了增强细胞结构的电子反差，需要对切片进行染色。染色是依据各种细胞结构与染色剂（重金属盐）结合的选择性，而形成不同的对电子散射能力，从而产生借以区别各种结构的反差。电子染色方法分块染色和切片染色两种：

1．块染色法，在脱水剂中加入染色剂，在脱水过程中对组织块进行电子染色。

2．切片染色法，最常用，即将载有切片的金属载网漂浮或浸没在染色液中染色。也可使用有微处理机控制的染色机进行自动化染色。一般切片染色所使用的染色剂为金属铀盐和铅盐的双重染色。为显示某种特殊结构，则可采用与该结构有特异性结合的选择性染色剂。