免疫标记技术

第六节　免疫标记技术

免疫标记技术是结合抗原抗体反应的特异性和标记分子极易被检测的高敏感性而建立的检测技术。免疫标记技术主要有荧光抗体标记技术、酶标抗体技术和同位素标记的抗体技术等。免疫标记技术的特异性和敏感性远远超过常规血清学方法，现已被广泛应用于基因表达产物分析、病原微生物鉴定及传染病诊断等各个领域。

一、荧光抗体标记技术

荧光抗体标记技术是用荧光素标记抗体或抗原，与相应的抗原或抗体特异性结合，然后用荧光显微镜观察荧光，以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。该技术是将抗原抗体反应的特异、荧光检测的高敏感性以及显微镜技术的精确性三者相结合的一种免疫检测技术。常用于标记的荧光素有异硫氰酸荧光素（FITC）、四乙基罗丹明（RB 200）和四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC），其中应用最广的是FITC。常用的操作方法有直接法、间接法（图13-8）。

荧光抗体标记技术具有快速、操作简便的特点，同时又有较高的敏感性、特异性和直观性，已广泛应用于细菌、病毒的鉴定和传染病的快速诊断。此外，还可用于淋巴细胞表面抗原或分子的测定和自身免疫病的诊断等方面。

二、酶标抗体技术

酶标抗体技术是根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应的高度敏感性建立起来的免疫学检测技术，具有敏感、特异、简便、快速、易于标准化和商品化等优点。该技术已成为免疫诊断、检测和分子生物学研究中应用最广泛的免疫学方法之一。已广泛应用于多种细菌病和病毒病的诊断和检测，如牛副结核、新城疫、猪传染性胃肠炎、猪伪狂犬病、蓝耳病、猪瘟、口蹄疫等传染病的诊断和抗体监测。常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以辣根过氧化物酶应用最广。

图13-8　荧光抗体标记技术

（一）免疫组织化学技术

免疫组织化学技术又称为免疫酶染色法，是将酶标记的抗体应用于组织化学染色，以检测组织和细胞中抗原的存在及其分布位置的技术。常用的方法有：直接法、间接法、抗抗体搭桥法、杂交抗体法、酶抗酶复合物法、增效抗体法等各种染色方法，其中直接法和间接法最常用。

（二）酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA），是当前应用最广、发展最快的—项新技术。其基本过程是将抗原（或抗体）吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶反应，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。试验方法主要有：直接法、间接法、夹心法、双夹心法、竞争法等。另外还有阻断ELISA、酶标抗体直接竞争法、酶标抗体间接竞争法、酶-抗酶抗体（PAP）法、SPA-ELISA和生物素（biotin）与亲和素（avidin）系统ELISA（简称BA-ELISA）以及斑点ELISA（Dot-ELISA）等。ELISA的常见类型见图13-9，13-10及13-11。

三、放射免疫分析

放射免疫分析是将放射性同位素测量的高度敏感性和抗原抗体反应的高度特异性结合起来而建立的一种免疫分析技术，可用于定量测定受检标本中的抗原或抗体，是目前最灵敏的一种方法，而且操作简便，便于标准化，其灵敏度可达纳克至皮克水平。该技术的广泛应用，为研究许多含量甚微而又很重要的生物活性物质在动物体内的代谢、分布和作用机制提供了新的手段，大大促进了医学和生物科学的发展。

图13-9　间接ELISA测抗体

图13-10　竞争法测小分子抗原

图13-11　双抗原夹心法测抗体

四、其他免疫标记技术

（一）免疫转印

免疫转印（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。该方法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种免疫分析技术。将含有目标蛋白（抗原）的样品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，通过转移电泳将凝胶中的蛋白质原位转印至硝酸纤维素膜或其他膜的表面，然后根据抗原抗体反应原理对转印膜上的蛋白质进行特异性检测。例如，将经SDS-PAGE分离的蛋白质带转移到膜上后，与第一抗体反应，膜经漂洗后再与酶标二抗反应，再加入生色底物反应之后，即可显示出目标蛋白的位置。免疫转迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，其优点是方法简便、标本可长期保存、结果便于比较，故广泛应用于免疫学、微生物学及其他生命科学等研究领域。

（二）核酸探针技术

核酸探针技术即预先用一个已标记上同位素或酶的已知DNA片段（核酸探针）来检验未知样品的DNA。核酸探针通常用某一段核酸片段制备。核酸探针具有灵敏度高、特异性强、使用方便等优点，可用于鉴定病毒、细菌以及某些真核细胞，对不易分离培养的病毒可直接鉴定。

【知识链接】

流式细胞术：荧光激发细胞分检器（Fluoresceince activated cell sorter, FACS）能快速、准确测定各荧光抗体标记的淋巴细胞亚群的数量、比例、细胞大小等，并将其分检收集，是当前免疫学研究尤其是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强有力的应用工具，又称流式细胞仪。应用流式细胞仪快速鉴定、分离细胞的技术称为流式细胞术。其基本原理为：通过喷嘴形成连续的线状细胞液流，并以每秒000～000个细胞的速度通过激光束。标记有荧光抗体的细胞发出荧光，荧光色泽、亮度等信号由光电倍增管接收和控制，再结合细胞的形态、大小产生光散射信号，其数据立即输入微电脑处理。可对细胞进行多参数的、快速的定量分析及细胞分选，是当代最先进的细胞定量分析技术。按照T细胞表面抗原的不同，用相应CD分子的单抗（荧光标记）与细胞表面相应抗原结合，即可对T细胞亚群进行检测。通常以CD3^＋代表T细胞总数，CD3^＋CD4^＋代表Th细胞，CD3^＋CD8^＋代表Tc细胞，用CD4/CD8的比值评价机体的细胞免疫功能。

根据细胞的荧光强度及大小的不同，细胞流在电场中发生偏离，最后分别收集于不同容器中。这种分离程序并不损害细胞活力，且可在无菌条件下进行，由此分出的淋巴细胞亚群能继续用于功能检测。此法分离的细胞的纯度可达90％～99％。这种方法还可用于分检淋巴细胞杂交瘤的细胞克隆，方法简便而灵敏。

【复习思考题】

1.免疫血清学技术有哪些基本类型？

2.影响免疫血清学反应的因素有哪些？

3.凝集反应和沉淀反应各有哪些类型？其基本原理是什么？

4.简述补体结合试验的原理与用途。

5.简述何为中和试验。

6.常用的免疫标记技术有哪些？

7.概述ELISA的主要方法。