荧光抗体免疫标记技术

荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescent antibody technique）。

荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分为若干种。与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。

由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。

1．荧光现象

（1）荧光的产生：一些化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。

荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接收能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间消失。

可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为致荧光，由化学反应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。

（2）荧光效率：荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。

荧光效率＝发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度）

发射荧光的光量子数亦即荧光强度，除受激发光强度影响外，也与激发光的波长有关。各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。选择激发光波长量接近于荧光分子的最大吸收峰波长，且测定光波量接近于最大发射光波峰时，得到的荧光强度也最大。

（3）荧光的淬灭：荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至淬灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。一些化合物有天然的荧光淬灭作用而被用作淬灭剂，以消除不需用的荧光。因此荧光物质的保存应注意避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。在荧光抗体技术中常用一些非荧光的色素物质如亚甲蓝、碱性复红、伊文思蓝或低浓度的过锰酸钾、碘溶液等对标本进行得当复染，以减弱非特异性荧光本质，使特异荧光更突出显示。

2．荧光物质

（1）荧光色素：许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：①异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）：为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。相对分子量为389．4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，有两种同分异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：人眼对黄绿色较为敏感；通常切片标本中的绿色荧光少于红色。②四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）：为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。③四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethyl rhodamine isothiocyanate，TRITC）：最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。

（2）其他荧光物质：①酶作用后产生荧光的物质。某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。②镧系螯合物：某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3＋）、铽（Tb3＋）、铈（Ce3＋）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3＋应用最广。Eu3＋螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。

3．免疫标记法

（1）荧光免疫法：原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与抗原抗体复合物（Mb）浓度呈正比，可在8min内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示（ΔMb）。该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。

以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体-抗原-抗体复合物。最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。

传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属（如铕）作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。

（2）放射免疫法（RIA）：放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原-抗体复合物与无放射性的抗原-抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后通过离心沉淀等方法，将抗原-抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng／ml水平。但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。

（3）酶联免疫法（ELISA）：ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb和微孔板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg／L，线性范围达1　000μg／L。夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性（r＝0．92）。ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及，但不适合急诊的快速检测。以双抗法为例。首先包被抗原，然后加入一抗，使一抗与包被抗原形成抗原-抗体复合物。接着加入酶标二抗，形成抗原-抗体-抗体复合物。最后加入底物，由酶催化底物生成产物。通过产物的生成量即可对蛋白抗原进行定量。

（4）偶联生物素-亲和素系统的酶免法：利用了1个亲和素分子可以与4个生物素分子结合的特性，使传统的灵敏度较高的酶免法的灵敏度又有明显的放大作用。

（5）时间分辨荧光免疫分析：时间分辨荧光免疫分析（timeresolved fluoroimmunoassay，TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。

（6）解离增强镧系元素荧光免疫分析：解离增强镧系元素荧光免疫分析（dissociation enhanced lanthanide fluoroimmunoassay，DELFIA）是时间分辨荧光免疫分析中的一种。它用具有双功能基团结构的螯合剂，使其一端与铕（Eu）连接，另一端与抗体／抗原分子上的自由氨基连接，形成Eu标记的抗体／抗原，经过免疫反应之后生成免疫复合物。由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱，因此加入一种增强剂，使Eu3＋从复合物上解离下来，自由Eu3＋同增强剂中的另一种螯合剂螯合形成一种胶态分子团，这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光，信号增强了百万倍。因为这种分析方法使用了解离增强步骤，因此称为解离增强镧系元素荧光免疫分析。