荧光定量技术

基于PCR基本原理，近年来PCR技术被大量改进，衍生了许多PCR新技术。如定量PCR、巢式PCR、反向PCR、差异PCR、多重PCR、标记PCR、锚定PCR、重组PCR、免疫PCR等。这里主要介绍目前常用的荧光定量PCR原理。

定量PCR（quantitative　PCR，Q－PCR）是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。根据PCR反应的指数增长特性，一些研究者通过改进方法来寻求扩增产物与样本中原始靶核苷酸之间量的关系，以达到对后者进行定量的目的。

定量PCR技术有广义概念和狭义概念。广义概念是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。狭义概念的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（检测扩增效率）达到精确定量起始模板数的同时以内对照有效排除假阴性结果（扩增效率为0）。

在PCR定量体系中，存在相对定量和绝对定量的问题。相对定量的目的是评估样品间核酸含量的差异，绝对定量的目的是确定某个样品准确的分子数。在DNA水平，因为很容易获得精确对照，易于获得绝对数值。而大多数mRNA含量在整个细胞周期中变化很大，且很难获得精确的RNA对照，所以mRNA的相对定量被广泛应用。

目前，最常用的定量PCR技术是实时荧光定量PCR（Real－time　Q－PCR）。

实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过1个循环，收集1个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化检测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

【基本概念】　为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值（threshold）和Ct值（cycle　threshold）。

1．荧光阈值　荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的1个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上。一般我们规定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值。荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。

2．Ct值　在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念，即Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：在PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

3．Ct值与起始模板的关系　研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值（图4－1）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

图4－1　Ct值和荧光阈值

【常用染料】　SYBR　GreenⅠ是一种只与DNA双链结合的荧光染料，能结合到双链DNA的小沟部位。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。因此，在1个体系内，SYBR GreenⅠ信号强度代表了双链DNA分子的数量。

1．荧光染料法定量PCR的基本过程

（1）开始反应，当SYBR　GreenⅠ染料与DNA双链结合时发出荧光。

（2）DNA变性时，SYBR　GreenⅠ染料释放出来，荧光急剧减少。

（3）在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。

（4）聚合完成后，SYBR　GreenⅠ染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。

（5）在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

2．用于核酸实时检测的优点

（1）对DNA模板没有选择性，适用于任何DNA，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好。

（2）使用方便，不必设计复杂探针。

（3）非常灵敏，且价格相对较低。

（4）利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔解曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分非特异扩增，进一步还可以实现单色多重测定。

（5）由于1个PCR产物可与多分子的染料结合，因此SYBR　GreenⅠ的灵敏度很高。

（6）通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR　GreenⅠ得到的定量结果。

3．用于核酸实时检测的缺点　由于SYBR　GreenⅠ与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。

【常用探针】　实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。

1．TaqMan荧光探针　PCR扩增时在加入一对引物的同时加入1个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记1个报告荧光基团和1个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5＇→3＇外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有1个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。

2．双标记寡核苷酸探针　该探针是一种在靶DNA不存在时能形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针，又称分子信标（molecular　beacon）。分子信标的茎环结构中，环一般为15～30bp长，并与目标序列互补；茎一般5～7bp长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。形成茎环结构后，荧光基团与淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后不是产生光子，而是将能量传递给淬灭基团，这一过程称为荧光谐振能量传递（FRET）。由于淬灭剂的存往，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。分子信标必须非常仔细的设计，以至于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子。

【缺点】　与常规的PCR技术相比，实时荧光定量PCR的不足之处如下。

（1）由于运用了封闭的检测，减少了扩增后电泳的检测步骤，因此也就不能监测扩增产物的大小。

（2）因为荧光素种类以及检测光源的局限性，从而相对地限制了实时荧光定量PCR的复合式（multiplex）检测的应用能力。

（3）容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性，但可以通过熔解曲线的分析，优化反应条件。

【研究应用】　实时荧光定量PCR技术是DNA定量技术的1次飞跃。运用该项技术，我们可以对DNA、RNA样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定量分所。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外我们还可以对PCR产物或样品进行定性分析。例如，利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体，以区分非特异扩增；利用特异性探针进行基因型分析及SNP检测等。目前，实时荧光定量PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面。

1．DNA或RNA的绝对定量分析　包括病原微生物或病毒含量的检测、转基因动植物转基因拷贝数的检测、RNAi基因失活率的检测等。

2．基因表达差异分析　例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异（如药物处理、物理处理、化学处理等），特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差异结果的确证。

3．基因型的分析　例如SNP检测、甲基化检测等。

【展望】　随着技术不断改进和发展，实时荧光定量PCR未来的应用前景是令人鼓舞的。一方面实时荧光定量PCR技术与其他分子生物学技术相结合使定量极微量的基因表达或DNA拷贝数成为可能，另一方面荧光标记核酸化学技术和寡核苷酸探针杂交技术的发展以及实时荧光定量PCR技术的应用，使定量PCR技术有一个足够的基础为广大临床诊断实验室所接受，将有助于临床医师对疾病的诊断和治疗。

（刘燕青）

参考文献

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