荧光定量标准品

(一)外标法的应用及其前景

外标法是核酸定量测定中较常使用的方法，这种方法与其他检测项目中使用标准曲线法相同，即在扩增待测样本的同时，扩增一系列已知拷贝数的与样本序列相同的标准品。由于模板量的对数值与定量PCR时得到的Ct值呈线性关系,将扩增标准时所得到的Ct值与标准的模板量的对数值做图可得到一条直线。根据得到的待测样本的Ct值，通过标准曲线可求得该样本拷贝数的对数值，经过相应的数学转换即可得到待测样本的拷贝数。

外标法非常简单方便，但是保证外标法准确度的前提是待测样本与标准品的扩增效率相同，当两者的扩增效率不同时将导致结果出现偏差。临床样本中往往含有很多能对扩增反应产生影响的物质，在核酸提取的过程中很难将这些物质完全去除。其结果是将含有相同病毒载量的不同标本放入不同的反应管中进行测定时，各个反应管内样本的扩增效率可能不同，最终可导致检测结果的不同。并且由于样本与标准品分别在不同的反应管中进行扩增,许多人为因素如加样、样本处理的不同以及PCR仪的各个孔间温度差别等，都对结果的准确性有影响。外标是独立于各个样本反应管之外进行扩增反应的，并且试剂盒中附带的外标往往是人工合成的质粒、噬菌体或病毒样颗粒等包装的基因片段，其基质中能对扩增产生影响的物质较少，故外标的反应条件往往是该次实验中最为理想的，其扩增效率也是最高的。各个样本反应管之间以及样本反应管与外标反应管之间扩增效率的差异最终导致的是样本检测结果的不准确。同时，外标是在模板提取完成之后准备开始扩增实验时加入的，不能反映核酸提取过程中对样本中模板量的影响。外标法存在的上述问题可以通过使用内标法加以解决。

(二)内标法的应用及其前景

内标法是将已知拷贝数的标准品加入待测样本中，与样本在同一管内扩增，然后通过内标的量来推算待测模板的量。根据标准品所使用的引物与扩增样本时所使用的引物是否相同，内标分为竞争性内标与非竞争性内标。

1.竞争性内标

竞争性内标扩增时所使用的引物与待测样本扩增所使用的引物相同，内标的一些性质如Tm值、GC含量等也与模板相同，但其探针结合区与样本的探针结合区不同，所以使用两种不同的探针可以分别将标准以及样本扩增时产物的增加量检测出来，这时内标与模板的扩增效率非常接近。利用实时定量PCR技术可以分别得到标准品以及样本的Ct值，由于标准的拷贝数已知，样本的量即可计算出来。由于标准与样本在同一管中进行扩增，所有影响扩增的因素都同时影响标准与样本，内标可以较好地模拟模板的扩增效率，从而消除了外标法的一些缺点。但是，加入内标后，使扩增反应成为双重PCR反应，两种模板将竞争引物、dNTP、Taq酶等，从而导致内标与样本模板之间产生干扰。如果模板量较标准量大，则抑制标准的扩增；反之，标准则抑制模板的扩增。因此这种方法只有在标准与模板浓度相差不大的时候，结果计算才更为准确。为解决这个问题，可在多个相同样本中分别加入一系列浓度的内标，然后进行实时定量PCR检测，得到一系列样本的Ct值以及一系列内标的Ct值，分别与内标拷贝数做图，可以得到两条直线，这两条直线相交叉处则为样本的拷贝数。而这种方法显然不适合应用于临床检验，目前推荐的方法是针对某种特定的内标进行大量的比较实验并最终确定一个较适宜的内标浓度，使用该浓度的内标对含有不同浓度模板的样本进行检测。

2.非竞争性内标

非竞争性内标的序列与模板完全不同，其扩增所使用的引物和探针结合区与待测样本扩增所使用的引物和探针结合区均不相同。非竞争性内标的核酸序列的选择多样，比如建立检测HBV核酸的非竞争性内标时可使用任意其他物种基因组的一部分序列，也可使用合成的全新序列。非竞争性内标在实际使用中对于加入量的要求并不似竞争性内标那样严格，实施较为容易。但由于非竞争性内标的核酸序列与样本中模板的序列不同，并不能完全模拟样本中模板的扩增效率，这是非竞争性内标相对于竞争性内标的一个较大的弱点。

与外标法相比，使用内标法可以获得更准确的结果，更能够反映送检样本的待测物真实浓度，但内标法所使用的标准品的设计和生产都较为复杂，生产成本和使用成本（每个反应管均需加入内标）以及对操作者的知识储备和经验储备的要求也较高。目前我国商品化的核酸检测试剂盒大多采用外标法。

(三)分子诊断试剂标准品的标准化

英国国家生物制品检定所(National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC)是WHO的一个国际标准品供应中心实验室，它的核心工作是制备、保存和分发WHO用于检测全球生物制品质量的标准品。世界卫生组织已确立了多个分子诊断实验的标准品，我国也依据NIBSC标准品建立了相应的国家标准品。标准品是荧光定量PCR诊断试剂盒定量的依据，目前常用的荧光定量PCR诊断试剂盒均配备定值标准品。为保证不同厂商的试剂盒检测结果的准确性和一致性，均需对其配套的标准品进行量值溯源。目前商品试剂盒中较常用的一种标准品为包含有特定核酸片段的质粒或脂质体，在完成标本的核酸提取后加入标准品，反应完成后根据标准曲线确定标本的模板浓度。荧光定量PCR实验与其他常规定量实验的一个不同之处是其前处理的步骤较为繁琐，核酸提取过程中不可避免地会造成核酸损失，而不同的核酸提取方法所造成的损失是不同的，这样就会造成提取后的样本模板浓度与样本中的实际待测物含量有所差别。为了校正这种差别，一些厂家的试剂盒使用经定量的患者阳性血清作为标准品，实验时将标准品与患者样本一起进行核酸提取和检测，这是以质粒为基础的标准品所无法做到的。由此造成的一个问题是即使上述两种标准品都能溯源至同一个国际标准品，但两种方法对标准品的处理步骤不同，最终仍可能导致两种方法测定的结果不具可比性。并且以患者阳性血清为标准品存在的一大问题是其具备一定的传染危险性，这无疑在产品的生产、运输和使用中都增加了相关参与者的致病风险。目前已研制出一种以λ噬菌体为外壳，内部包含特定核酸片段的标准品，这种标准品可以同样本一起经历核酸提取步骤且不具传染危险性，同时具有良好的稳定性，可较好地满足临床检验的需要。如各个厂商的试剂盒均使用同一技术标准的标准品，无疑会增加实验室间检测结果的可比性，但目前很多厂商的标准品均已申请专利并作为封闭的技术加以保护，实现分子诊断试剂盒标准品的标准化还需要相关部门和厂商的共同推动。

(四)不同检测模式造成的影响

1.SYBR Green I染料技术

SYBR Green I是荧光定量PCR常用的DNA结合染料，与双链DNA非特异性结合。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，其荧光增加1000倍。所以，一个反应发出的全部荧光信号与生成的双链DNA量具备数量关系，且会随扩增产物的增加而增加。双链DNA结合染料的优点包括：实验设计简单，仅需要2个引物，不需要设计探针，无需设计多个探针即可以快速检验多个基因，具备较好的初始成本优势。DNA结合染料最大的缺点是缺乏特异性，即DNA结合染料可以结合任一双链DNA，因此荧光PCR反应中非特异性产物的出现会增加荧光值，而且SYBR Green I还会对一些PCR反应产生干扰，这些都会影响定量结果的准确性。另外，因为不能区分不同模板扩增时发出的荧光，SYBR Green I不能用于多重反应。在临床检测中SYBR Green I暴露出来的问题是其检测荧光的本底较高，在一些检测项目中假阳性率过高，由此产生的额外成本已经超出了它自身的优势，所以目前在临床分子诊断中较少使用。

2. Taqman探针技术

Taqman探针技术属于水解探针技术的一种，除了一对特异性引物，Taqman探针法增加一条和模板互补的基因特异性探针（通常20～30bp），探针上5'端和3'端分别标记了一个报告荧光基团（供体）和一个淬灭荧光基团（受体），在反应初始（探针完整）时系统激发供体而产生的荧光信号被邻近的淬灭基团吸收，所以此时检测不到供体荧光信号；而当PCR过程中Taq DNA聚合酶扩增到探针结合模板的位点时，其5'-3'核酸外切酶的活性（也就是切口平移）切割掉探针5'端的报告基团——游离的报告基团远离淬灭基团，打破能量的传递，激发报告基团产生的荧光信号就可以被荧光检测系统检测到。这样每扩增一条DNA链，就对应有一个游离的荧光分子（报告基团）形成，保证了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，因此对荧光信号进行检测就可以实时监控PCR的过程，准确定量PCR的起始拷贝数。

相对于DNA染料技术，Taqman探针技术的灵敏度和特异性较高，具有模板序列特异的Taqman探针在引物特异的基础上进一步提高定量PCR的专一性；每扩增一个特异产物只释放一个分子的荧光染料，仪器检测的是特异扩增的结果，非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的专一性；并且有多种不同波长的荧光基团对可供选择，使得Taqman探针法可以实现在同一管内检测多重PCR，降低成本的同时也提高了效率和准确性，同时也避免了荧光染料对PCR反应的影响。其弱点在于探针设计有一定难度，需要验证效果，探针的合成和双荧光标记成本较高。但Taqman探针法利用了Taq酶的外切活性，定量PCR的效率有可能受酶外切活性的影响，而由于各家公司出产的Taq酶对于其外切酶活性大都没有做出精确的活性标定，不同种类酶之间的活性差异也给定量带来了不确定性。但这些不确定性对临床检测的影响较小，质量合格的试剂盒大都能将其控制在可接受的范围之内。目前临床分子诊断所使用的实时定量PCR试剂盒大都是基于Taqman探针法设计的。