荧光光谱法

分子具有不同的能级， 电子处于不同的能级中。 通常情况下分子的电子处于最低的能级状态，即基态，用S0表示。当光照射到分子上时，电子被激发，从低能级跃迁到高能级，即激发态，用S1，S2，…表示。高能级的电子不稳定，通过辐射跃迁和非辐射跃迁失去能量返回基态， 而荧光就是激发态的分子和原子返回基态过程中放射出来的一种光能。 若被光照射激发的是分子， 发出的是分子荧光。

不同物质的激发光谱和荧光发射光谱不同； 同一物质， 其他条件相同而浓度不同时， 其荧光强度不同。

（1） 荧光激发光谱： 固定荧光发射波长和狭缝宽度扫描， 得到荧光激发波长和相应荧光强度关系的曲线， 即荧光激发光谱。

（2） 荧光发射光谱： 固定荧光激发波长和狭缝宽度扫描， 得到荧光发射波长和相应荧光强度关系的曲线， 即荧光发射光谱。

荧光光谱仪的组成有光源、 单色器 （滤光片或光栅）、 液池、 检测器和显示器。 荧光光谱仪与紫外-可见分光光度计有两点不同： ①有两个单色器； ②检测器与激发光互成直角。

光源发出的光经第一单色器（激发光单色器），得到所需要的强度为I0的激发光波长，通过液池， 部分光线被荧光物质吸收， 荧光物质被激发后， 向四面八方发射荧光， 为了消除入射光及杂散光的影响， 荧光的测量在与激发光成直角的方向。 经过第二单色器（荧光单色器）， 将所需要的荧光与可能共存的其他干扰光分开。 荧光照在检测器上， 光信号变成电信号， 经放大后， 由记录仪记录。

1. 光源

光源发出所需波长范围内的连续光谱， 有足够的光强度， 稳定。

（1） 可见光区： 钨灯， 碘钨灯（波长320～2500nm）；

（2） 紫外区： 氢灯， 氘灯（波长180～375nm）；

（3） 氙灯： 紫外、 可见光区均可用作光源。

2. 单色器

荧光光谱仪用滤光片作单色器， 荧光光谱仪只能用于定量分析。

大多数荧光光谱仪采用两个光栅单色器， 有较高的分辨率， 能扫描图谱， 既可获得激发光谱， 又可获得荧光光谱。

（1） 第一单色器的作用：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长λex，用此激发光激发液池内的荧光物质。

（2） 第二单色器的作用： 滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光， 用来选择测定用的荧光波长λem。在选定的λem下测定荧光强度，进行定量分析。

3. 样品池

样品池盛放测定溶液， 通常是石英材料的方形池， 四面都透光， 只能用手拿棱或最上边。

4. 检测器

检测器把光信号转化成电信号， 放大， 直接转成荧光强度。

荧光的强度一般较弱， 要求检测器有较高的灵敏度， 荧光光谱仪采用光电倍增管。

荧光光谱法比红外吸收光谱法具有高得多的灵敏度， 这是因为荧光强度与激发光强度成正比， 提高激发光强度可大大提高荧光强度。

5. 读出装置

记录仪记录或打印机打印出结果， 扫描激发光谱和发射光谱。