荧光技术的应用

荧光技术的应用

物质的定性

不同的荧光物质有不同的激发光谱和发射光谱，因此可用荧光进行物质的鉴别。与吸收光谱法相比，荧光法具有更高的选择性。

定量测定

利用在较低浓度下荧光强度与样品浓度成正比这一关系可以定量分析样品中荧光组分的含量，常用于测定氨基酸、蛋白质、核酸的含量。荧光定量测定的一个优点是灵敏度高，例如维生素B₂的测定限量可达1毫微克／毫升，这一优点使测定时所需要样品量大大减少。

这种定量测定方法还可应用于酶催化的反应，只要反应前后有荧光强度的变化，就可用来测定酶的含量及酶反应的速率等。

研究生物大分子的物理化学特性及其分子的结构和构象。荧光的激发光谱、发射光谱、量子产率和荧光寿命等参数不仅和分子内荧光发色基团的本身结构有关，而且还强烈地依赖于发色团周围的环境，即对周围环境十分敏感。利用此特点可通过测定上述有关荧光参数的变化来研究荧光发色团所在部位的微环境的特征及其变化。在此研究中，除了利用生物大分子本身具有的荧光发色团（如色氨酸、酪氨酸、鸟苷酸等，此类荧光称为内源荧光）以外，可将一些特殊的荧光染料分子共价地结合或吸附在生物大分子的某一部位，通过测定该染料分子的荧光特性变化来研究生物大分子，这种染料分子被称为“荧光探针”，它们发出的荧光一般称为外源荧光。荧光探针的应用，大大地开拓了荧光技术在分子生物学中的应用范围。

利用荧光寿命、量子产率等参数可以研究生物大分子中的能量转移现象。通过该现象的研究，可以获得生物大分子内部的许多信息，如分子内两基团之间的临界距离可根据弗尔斯特公式来测定，弗尔斯特公式如下：

即是两荧光发色团之间的能量传递的速率K_DA和它们之间的临界距离R₀的六次方成反比。式中的K_DA、K、J等均可由荧光寿命、量子产率及荧光强度的测定来推算，从而可以得知两基团之间的距离。

以往人们常用荧光偏振做指标来研究生物大分子动力学。近年来人们趋于用荧光偏振随时间的衰减来研究这些问题。在这种方法中，激发光不是一连续的面偏振光，而是一偏振的光脉冲，因此测得的F_n和F_⊥是在两个不同方向上偏振的荧光随时间的衰减，它既和荧光寿命τ有关，又与分子在溶液中的运动有关，因此常表示为F_N（t）和F_⊥（t）。由它们可得一相当重要的物理量——各向异性参数A（t）。

由A（t）可推测生物大分子的形状、分子转动弛豫时间（即从一个定向的状态到一个无定向状态所要的时间），进而可以推知生物大分子的大小、分子在溶液中的转动角度和时间之间的函数关系。由这些结果可以研究分子之间的相互作用、分子间结合的紧密程度、蛋白质、核酸分子的解聚程度等等。

另外，荧光技术在免疫学中亦有广泛的应用。最重要的就是荧光抗体法。将某些荧光染料与血清抗体相结合，这种标记的抗体仍可专一地与相应抗原发生结合，形成的复合体具有荧光特性，从而可以确定抗原或抗体的存在及其含量。