实时荧光定量多聚酶链反应分析法

多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与体内相似，不同之处是以耐热的Taq酶取代DNA聚合酶，以合成的DNA引物替代RNA引物，用加热(变性)、冷却(退火)、保温(延伸)等改变温度的办法使DNA得以复制，反复进行变性、退火、延伸循环，就可使DNA无限扩增。用于PCR的模板核酸可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，首先要进行反转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。实时荧光定量PCR(Real－Time Quantitative PCR，RT－qPCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。在传统的PCR中，常用凝胶电泳分离结合荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，而在RT－qPCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测，连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，并且由此来推断最初模板的含量。为了便于对所检测样本进行比较，在RT－qPCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值，一般这个域值(threshold)是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号(baseline)，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到荧光信号超过域值则被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数(Ct)。Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

目前RT－qPCR所使用的荧光化学方法主要有5种，分别是:DNA结合染色、水解探针、分子信标、荧光标记引物、杂交探针。它们又可分为扩增序列特异和非特异的检测两大类。

RT－qPCR的应用范围很广泛，包括mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性(SNPs)的测定等。