荧光定量检测的基本原理

实时荧光定量PCR技术（real-time quantitative polymerase chain reaction，简称Real Time PCR）是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国应用生物系统（Applied Biosystems，AB）公司推出，是目前确定样品中DNA（或cDNA）拷贝数最敏感、最准确的方法。如果用于RNA检测，则被称为反转录实时PCR。

Real Time PCR是指对DNA或经过反转录（RT-PCR）的RNA通过聚合酶链式反应并实时监测DNA的放大过程，在扩增的指数增长期就测量扩增产物，因为扩增指数增长期测量值与特异DNA（RNA）起始量存在相关性，从而实现定量检测。Real Time PCR的基本目标是精确测量和鉴别非常微量的特异性核酸，从而可通过监测阈值循环（Ct）而实现对原始目标基因的含量定量。实时荧光定量PCR法最大的优点是克服了普通PCR进入平台期或（叫饱和期)后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。

所谓实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。图7-3显示了一个代表性的扩增曲线，其中包括表7-3中列举的一些术语。

图7-3 Real-time PCR 的扩增曲线（Higuchi R，Fockler C，Dollinger G，et al.）（见彩图）

表7-3 荧光定量PCR中常用的术语

(续表)

一、实时定量PCR的系统构成及工作原理

荧光定量检测系统由实时荧光定量PCR仪、实时荧光定量试剂、通用电脑、自动分析软件等构成。

目前，在国内使用较多的荧光实时定量PCR仪有美国应用生物系统（AB）公司的7000、5700、7900、7700型和Roche公司的LightCycler等。

该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的。其原理：随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

一般而言，荧光扩增曲线可以分成3个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，根据最终的 PCR 产物量也不能计算出起始DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。

1．Ct值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念——Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

2．荧光域值（threshold）的设定 荧光域值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3～15个循环荧光信号标准偏差的10倍。

3．Ct值与起始模板的关系 Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。因此，能够利用Real-time PCR进行核酸定量，其原理如图7-4所示。将已知浓度的标准品梯度稀释进行Real-time PCR反应（图7-4A）。以在扩增产物呈指数增长区域内得到的达到一定扩增产物量时的循环圈数Ct值为横坐标，以起始DNA量为纵坐标，制作得到标准曲线（7-4B）。将未知浓度的检测样品，以相同条件进行PCR反应，求出其Ct值，再将其Ct值在标准曲线上检定检测样品中的目的DNA量。

图7-4 Real-time PCR原理示意图

A. 梯度稀释标准品的扩增曲线；B. 标准曲线

4．荧光化学 荧光定量检测根据所使用的标记物不同可分为荧光探针和荧光染料。荧光探针又包括Beacon技术（分子信标技术，以美国人Tagyi为代表）、TaqMan探针（以美国AB公司为代表）和FRET技术（以罗氏公司为代表）等；荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，非饱和荧光染料的典型代表就是现在最常用的SYBR GreenⅠ；饱和荧光染料有EvaGreen、LC Green等。

（1）TaqMan荧光探针：本技术的原理（图7-5）是使用荧光基团标记探针，5'端标记荧光基团R，3'端标记淬灭基团Q，在没有PCR扩增时，由于荧光基团和淬灭基团空间距离很近，使荧光基团被淬灭，不发荧光；而当PCR扩增时，引物与荧光标记的特异性探针同时结合在模板上，荧光标记的探针与模板的结合位置位于上、下游引物之间，利用Taq酶的5'→3'外切酶活性，将荧光探针水解，荧光基团被释放出来，由于在空间上与淬灭基团分开，则发出荧光。发出的荧光可以被荧光探头检测到，一边扩增，一边检测，这样就实现了“实时”检测。该技术不仅实现了PCR从半定量到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性强、自动化程度高、有效解决了PCR污染问题等特点。

（2）SYBR荧光染料：SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，与双链DNA非特异性结合。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，其荧光增加1 000倍。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链DNA量呈比例，且会随扩增产物的增加而增加。

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

SYBR Green I 在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链 DNA 相结合，不必因为模板不同而特别定制，所以设计的程序通用性好，且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链 DNA 熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分非特异扩增，还可以进一步地实现单色多重测定。此外，由于一个 PCR 产物可以与多分子的染料结合，所以 SYBR Green I 的灵敏度很高。但是，由于 SYBR Green I 与所有的双链 DNA 相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由 SYBR Green I 得到定量结果。

图7-5 实时荧光定量PCR技术示意图（见彩图）

二、荧光定量PCR基本实验步骤

一般TaqMan定量PCR实验过程为：目的基因查找比对 → 探针与引物设计 → 探针与引物合成 → 配置反应体系 → 设置反应参数 → 重复实验，优化条件 → 获得曲线数据，比对标准曲线 → 再重复验证。

【材料】

1．引物和探针 事先准备用于检出和定量对象基因序列的引物对和探针。引物和探针的设定请根据各种分析方法的特点设计。目标片段的长度也很重要，一般目标片段越长越容易产生非特异性反应，扩增效率也较低，所以目标片段最好控制在200bp以下，建议尽可能在150bp以下。引物和探针设计的基本原则如下。

（1）先选择好探针，然后设计引物使其尽可能地靠近探针。

（2）所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段。这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，则要相应提高退火温度。

（3）扩增长度应不超过400bp，最好能在100～150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。

（4）保持GC含量在20%～80%，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及在荧光染料分析中出现非特异信号。

（5）为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）。

（6）将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。

2．Realtime PCR Master Mix（TOYOBO CO.，LTD） 已经包含除引物以外所有的PCR反应所需的试剂，如dNTP、MgCl2、Taq DNA聚合酶、抗Taq单克隆抗体等。

3．Realtime PCR仪 使用Applied Biosystems公司的ABI PRISM®7700、Roche Diagnostic公司的LightCyclerTM、BioFlux公司的LineGene等的Real Time PCR仪。使用方法参照各仪器的说明书。

4．样品DNA

（1）cDNA：第一链cDNA合成产物，可使用苯酚处理、乙醇沉淀等方法提纯。第一链 cDNA合成时的引物，可采用随机引物、oligo（dT）或者特异性引物，并注意引物用量对于后续PCR反应的影响。

（2）基因组DNA等：使用普通PCR的DNA纯化样品。如果是人类基因组DNA，用量在1～10ng比较合适。

【操作步骤】 下面以ABI PRISM®7700的TaqMan®分析法为例做一简要介绍。

1．反应液的配制 PCR反应液（终浓度：引物 0.8µmol/L、探针 0.2µmol/L；总体积为50µl）。

●蒸馏水　　　　　　　　　　　　　10µl

●Realtime PCR Master Mixa　　　　25µl

注意：将Realtime PCR Master Mix设定为总液量的1/2，其他的组成成分请参照最适当条件改变。

●引物1 （10µmol/L）　　　　　4µl

●引物2 （10µmol/L）　　　　　4µl

注意：①请在终浓度为0.2～1µmol/L的范围内进行调整；②扩增效率不高时，可适当增加引物的用量。

●TaqMan®探针（5µmol/L） 2µl

注意：①请在终浓度为0.05～0.3µmol/L的范围内进行调整；②使用商品化的引物和探针Mix时，请参照其指定浓度。

●样品溶液　　　　5µl

●总体积　　　　　50µl

注意：如果要改变反应总体积，应保持最适当条件下的各组分比例。

2．PCR的循环条件 复性／延伸温度，应结合引物和探针的实际情况进行调整。使用商品化引物和探针Mix时，参照其说明进行调整。

该产品可以在极短时间内释放多聚酶的活性，因此，最初的变性时间可以设定为60s，循环中变性时间可以设定为15s。

Realtime PCR一般不进行长片段的扩增，所以一般不需要进行延伸时间的调整。如必须调整，也务必确保数据收集（data collection）步骤至少30s。

详细的设定参照定量PCR仪的说明书。下面是PCR实例。

PCR循环 （二步骤法、复性／延伸温度 60℃）

【常见问题及对策】

1．扩增曲线混乱

（1） PCR仪设定方面的问题（参照相应仪器的说明书）：见表7-4。

表7-4 PCR仪设定方面的问题及对策

（2）试剂方面的问题：见表7-5。

表7-5 造成扩增曲线混乱的试剂方面的问题及对策

2．定量值重现性差

（1）仪器设定方面的问题（参照相关仪器的说明书）：因为仪器的不适用，在温度管理或检测时重现性差，应根据相应仪器的说明书进行检查。

（2）试剂方面的问题：见表7-6。

表7-6 造成定量值重现性差的试剂方面的问题及对策

(续表)

（危 敏）