免疫荧光染色技术（免疫荧光组织化学技术）

第六节　免疫荧光染色技术（免疫荧光组织化学技术）

免疫荧光技术创建于1941年，早期主要用于微生物快速检验，至今已有很大的进展，成为现代生物学和医学中广泛应用的技术。免疫荧光染色方法是抗原、抗体反应的特异性与荧光色素的放大显示相结合的免疫学检测技术；用荧光素标记已知抗体（或抗原），与待检组织细胞中的抗原（或抗体）结合，荧光显微镜下，可分辨出抗原（或抗体）的所在位置及其性质。免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。

免疫荧光技术

一、分类（根据操作程序与荧光素标记物分类）

1．直接法　用荧光素标记抗体（抗原），多用于示踪微生物与组织细胞中的抗原（抗体）成分。

2．间接法　用荧光素标记第二抗体，主要用于示踪组织细胞表面的抗体。

3．补体法　荧光素标记抗补体C₃抗体与补体结果反应相结合，提高荧光强度。

4．膜抗原免疫荧光法　多用于活检淋巴细胞和肿瘤细胞的膜抗原定位。

5．双重免疫荧光法　可在同一标本上定位、定性检测两种抗原。

二、特点

1．特异性与形态学相结合　抗原和抗体反应特异性与组织细胞形态学特征相结合，形象直观，一目了然。

2．快速性　按常规操作程序，1h出结果。

3．高敏感性　检查细菌，一般每毫升含5000个菌体，即能获得阳性结果，而凝集试验则需百万个菌体以上。

4．适用范围广。

5．局限性　目前基本上只作为定性方法使用。

三、常用荧光色素

1．异硫氰酸荧光黄（FITC）　呈明亮的黄绿色荧光。

2．四乙基罗丹明（RB200）　 呈明亮的橙色荧光。

3．四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC）　呈橙红色荧光。

4．二氯三嗪基氨基荧光素（DTAF）　呈红色荧光。

四、免疫荧光染色直接法基本程序

1.采集标本。

2.制片。

3.免疫染色。

4.荧光显微镜观察染色结果。

五、非特异性荧光及其消除方法

（一）产生非特异性荧光的原因

1．组织细胞的某些成分可呈现自发荧光。

2．某些组织细胞（如结缔组织，衰老细胞等）非特异性吸附荧光素。

3．结合物中游离荧光素过多。

4．荧光标记物应用液中荧光标记物含量过高。

5．免疫荧光染色时间过长。

6．洗涤不彻底。

鼠疫菌荧光染色图片

（二）消除非特异性荧光可以选用的方法

1．用非免疫血清，如10%牛血清温育后再进行荧光抗体染色。

2．层析或透析去除游离荧光素。

3．将荧光标记物的浓度调整到合适浓度。

4．标本经酶消化后再做荧光标记物染色。

5．选择合适的制片方法，如冰冻切片非特异性荧光较强，而石蜡切片的非特异性荧光则较少。

六、其他问题

1．所用载玻片、盖玻片光洁，封固剂、镜油无色透明。无自发荧光。

2．冰冻切片厚5～10μm，避免切片折叠或杂质过多。

3．荧光显微镜观察标本时，注意防止眼睛被紫外线灼伤。

4．荧光显微镜每次使用时间以1～2h为宜，时间过长将使高压汞灯的发光亮度下降，荧光减弱。

5．荧光亮度的目测标准一般分级：“－”无或仅见微弱荧光，“＋”明显可见的荧光，“＋＋”明亮的荧光，“＋＋＋”耀眼的荧光。

6．荧光染色片不易长久保存，易褪色，甘油封固片周围再用石蜡密封，放置4℃避光可延长存放时间。

7．设置对照阳性标本对照；阴性标本对照；自发荧光对照。

七、免疫荧光染色技术检查鼠疫菌试验

（一）免疫荧光染色前的准备

1．纯化IgG抗体的准备　取高效价纯化抗体，用盐水（0．15mol／L NaCl）及缓冲液（0．15mol／L NaHCO₃-Na₂CO₃ pH9．0）稀释，使每毫升内含蛋白10mg（缓冲液为总量的10%），降温至4℃，加入异硫氰酸盐荧光素，（蛋白∶荧光素＝50mg∶1mg～80mg∶1mg），在0℃～4℃下电磁搅拌12～14h。然后用半饱和硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵（用Nessler氏试剂测验至隔夜透析之盐水无氨离子及荧光色素为止）。将制备好的荧光抗体加叠氮钠0．01%，分装在1ml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中（4℃）可以用半年以上，－20℃保存可达2年以上。

抗体的准备：将纯化的IgG抗体兑pH9～9．5碳酸盐缓冲液透析过夜，透析后抗体液移入小烧杯中，并使最后蛋白浓度为10mg／ml。

2．荧光素的准备　称取适量FITC，加入二甲亚砜（DMSO），使FITC／DMSO的终浓度为1mg／ml。若IgG浓度为1mg／ml，则FITC／IgG比例约为50μg／mg。

标记：边搅拌边将荧光色素渐渐加入蛋白溶液中，避免将荧光素黏于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上（5～10min内加完），加毕后，继续搅拌12～18h。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故需及时添冰去水；亦可将结合装置安放在4℃冰箱或冰库中。

3．透析　结合完毕后，将蛋白的溶液离心（2500r／min）20min，除去其中少量之沉淀物，装入透析袋中后再置于烧杯中，用pH8．0缓冲盐水透析（0～4℃）过夜。

4．过柱　取透析过夜的标记物，用PD10柱（Sephadex G25柱）除去游离荧光素，收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰。

5．特异性染色效价的测定　直接染色以倍比稀释荧光抗体溶液如1∶2，1∶4，1∶8……与相应抗原标本作一系列染色，荧光强度在“＋＋＋”的最大释度，即为该荧光抗体的染色滴度（效价）或单位。实际染色应用时，可取低一个或两个稀释度（即2～4个单位）。

6．非特异性染色测定　根据荧光抗体的用途不同，可用相类似的抗原切片或涂片，倍比稀释荧光抗体，按常规染色，结果在标本上出现的非特异染色应显著低于特异染色滴度，否则应采取消除非特异性染色的方法处理荧光抗体。

7．吸收试验　在荧光抗体中加入过量相应抗原，于室温中搅拌2h后，移入4℃过夜，3000r／min，离心30min，收集上清液，再用以染色相应抗原阳性标本，结果应不出现明显阳性荧光。

8．抑制试验　即在标本中先加入相应抗体，于湿盒反应30min后，洗片，再加入荧光抗体，结果应不出现明显阳性荧光。

9．F／P比值的计算　F（荧光素）和P（抗体蛋白）的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量，一般要求F／P的克分子比值为1～2。过高时，非特异性染色增强；过低时，荧光很弱，降低敏感性。

（二）试剂

1．FITC－F₁McAb　FITC（异硫氰酸荧光黄）标记鼠疫F₁单克隆抗体。临用前按说明书配制应用液。

2．固定液　75%乙醇

3．稀释洗涤液p　H7．2，0．01mol／L磷酸盐缓冲液（PBS），含升汞0．5%，小牛血清1%。

4．封固剂　甘油和0．5mol／L pH9．0～9．5碳酸盐缓冲液的等量混合液。

5．镜油、二甲苯、擦镜纸等。

（三）器材

1．荧光显微镜。落射型光源对眼睛损害较小。

2．载玻片（厚度0．8～1．2mm）；盖玻片（厚度为0．17mm左右）。

（四）标本制备与涂片

1．采取标本按强毒操作程序进行，留足细菌学检验标本，及时编号记录。

2．细菌培养物制片

（1）菌落：用白金耳蘸取菌落，加pH7．2 PBS研成菌液，涂片。

（2）液体培养：蘸取菌液，直接涂片。

3．脏器或组织标本制片

（1）压印标本：将脏器组织切面轻轻在载玻片上压印。

（2）剪碎并研磨成糊状，加等量稀释洗涤液，研磨3min，移入试管，用等量稀释洗涤液冲洗乳钵，取混悬液涂片，或移入试管，盖胶塞后摇匀。

（3）试管外部用消毒液浸泡后，可从强毒实验室移到弱毒实验室。

（4）组织悬液差速离心集菌涂片：组织悬液500r／min，5min后弃去沉淀，上清经3000r／min，5min后，取沉淀直接涂片。差速离心集菌涂片，可提高阳性检出率。

4．涂片自然干燥。

（五）荧光染色

1．设置对照　同步做阴性、阳性标本对照和自发荧光对照。

2．固定、杀菌　用75%酒精固定标本10min，酒精亦起到杀菌作用。清水冲洗。

3．浸洗含　1%牛血清PBS浸洗标本5min。流水冲洗。

4．荧光染色　加FITC－F₁McAb适量（约0．2ml），室温作用30min，流水冲洗。

5．干燥　用滤纸吸去水珠，自然干燥。

（六）观察记录结果：荧光显微镜观察

1．注意防止眼睛被紫外线灼伤。

2．对照标本荧光染色结果必须与已知阳性、阴性相符，被检标本无自发荧光。

3．镜检可看到的现象：无荧光或仅见微弱荧光，清晰可见的荧光，明亮的荧光，耀眼的荧光。

4．按镜检荧光染色清晰菌体量分级：未看到（－），平均每视野有1～5个（＋），每视野5个以上（＋＋），满视野（＋＋＋）。

（七）报告检验结果

1．逐项填写报告单。

2．填写检验结果

检验方法名称：FITC－F₁McAb免疫荧光染色技术检查鼠疫菌试验

检验结果：检出免疫荧光染色阳性杆菌（＋）或（＋＋）；未检出免疫荧光染色阳性杆菌（－）。