显微镜荧光光度术

显微镜荧光光度术

测定材料在荧光显微镜下所产生荧光像的荧光强度的技术。由于荧光是由荧光物质直接产生，所以测量时没有分布误差、灵敏度高、且能利用不同的激发光测定一个样品的多种荧光物质，因而可对同一个细胞的多种成分如DNA、RNA和蛋白质进行相关测定。荧光强度的测定可用透射光或落射光照明，最常用的是利用落射光明场照明的荧光照明器。

在落射光照明时，荧光物质的浓度和荧光强度遵守以下公式：

F＝I₀Qrel（1－e－kcd）

式中F为荧光发射强度；I₀为照明的落射光强度；Qrel为相对量子产额；K为荧光物质的克分子消光系数；C为荧光物质的浓度；d为荧光物质厚度。

只有在一定的条件下（落射光照明和荧光物质低浓度时），荧光发射强度和荧光物质浓度间是近似的线性关系。与吸收光度术不同，因受仪器因素的影响，显微镜荧光光度术所测的荧光强弱只是一个相对的数值。所以需要一种荧光标准（一般用铀玻璃）来校正整个仪器状态。还需要一种生物样品作为内插标准（如淋巴细胞），它与所测定的样品同时染色和测量，以便于不同制备条件下的样品之间能互相比较。

利用显微荧光光度计可以测定：细胞中荧光物质如脂褐素、叶绿素和血红素的含量，免疫荧光的强度，神经递质生物单胺的荧光强度。此外，通过测定酶作用后荧光底物所产生的荧光强度可以测定酶的含量和酶的动力学参数。利用特异的荧光染料和细胞的一定成分相结合，如果二者呈化学计量关系，则通过测量荧光染料的荧光强度，可以间接测得细胞成分的含量。

在物镜和光电倍增管之间加上一个单色器，则可通过改变波长测定荧光发射光谱，用于鉴别组织和细胞中的荧光物质，还可用于研究细胞中的能量转移现象。此外它也是掌握显微荧光测量条件所必要的。

显微荧光光度术的优点是在测量荧光强度的同时，还能确定荧光物质在组织及细胞中的部位。不足之处是测量时荧光容易消褪，还常有自发荧光和非特异性荧光的干扰，以至影响了测量的准确性。20世纪70年代以来用光多道分析仪测量细胞的荧光发射谱（仅用32msec），可弥补这些缺点。