分光光度法吸光度与溶液浓度关系

光化学分析法可分为非光谱法与光谱法两大类。非光谱法是指那些不以光的波长为特征信号，仅通过测量电磁辐射的某些基本性质（反射、折射、干涉、衍射及偏振）等的变化的分析方法。这类方法主要有折射法、比浊法、旋光法及衍射法等。光谱法主要是基于光的吸收、发射、拉曼散射等作用而建立的分析方法，它通过检测光谱的波长和强度来进行定性和定量分析。

分光光度分析法是光学分析法的一种，是通过测量溶液中被测组分对一定波长光的吸收程度，以确定被测物质含量的方法。这种依据物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，称为吸光光度法或是分光光度法。它主要有红外吸收光谱、紫外吸收光谱、可见吸收光谱。

6．2．1 分光光度法原理

基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法，称为吸光光度法。

许多物质是有颜色的，如水合铜离子呈蓝色，高锰酸钾溶液呈深紫色。另外，有些物质本身并没有颜色或有颜色但不够明显，但当它们与某些化学试剂反应后，则可生成颜色明显的物质，如Fe3＋和SCN-反应可生成血红色物质。这些有色溶液颜色的深浅与这些物质的浓度有关，溶液越浓则颜色越深。因此，可通过比较溶液颜色深浅来测定物质的浓度，这种测定的方法称为比色分析法。

目前，已广泛地使用分光光度计进行这种分析。它不仅可测定有色物质，而且对一些无色物质也可以测定；不仅可用于定量分析，也可用于定性分析，显然拓宽了比色分析的范围，故又将这类分析方法称为分光光度法。它包括可见-紫外分光光度法、红外分光光度法等。一般就将上述方法统称为吸光光度法。本部分只介绍可见光区的吸光光度法。与质量法、容量法等相比，吸光光度法具有以下特点：

1）灵敏度高

吸光光度法用于定量分析时，所测试液的浓度下限可达10-6～10-5mol／L，相当于0．001％～0．0001％的微量组分，因而具有较高的灵敏度，适用于微量组分的测定。近年来合成的系列新显色剂，将吸光光度法应用领域拓宽到痕量组分。

2）准确度高

吸光光度法测定的相对误差为2％～5％，其准确度虽不如容量法和质量法，但对微量组分的测定已是比较满意了，因为此时用容量和质量法测定也不够准确，甚至无法进行测定。

3）操作简便，测定速度快

所用仪器简单，操作简便。进行分析时，试样处理成溶液后，一般只经历显色和测定两个步骤，就可得出分析结果。

4）应用广泛

仪器价格便宜，应用广泛。几乎所有无机离子和大多数有机物都可直接或间接地用此方法测定。另外，通常还用于测定配合物的配合比，配合物及酸碱物质的平衡常数等。因此，吸光光度法对于生产和科研都有着极其重要的意义。

6．2．2 物质对光的选择性吸收

已知，光是一种电磁波。可见光、紫外线、红外线、X射线等都是电磁波。各种电磁波的区别在于它们的频率（或波长）不同。不同频率的光，其能量也不同。它们的关系为

上式表明，波长越短，则E越大，所以短波能量高，长波能量低。同一波长的光称为单色光。波长在400～750nm范围内的电磁波，依不同的波长而呈现红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等颜色。人眼能感受到的阳光或白炽灯所发出的光，就是由400～750nm的各种波长的单色光混合而成的。由此可知，白光为复色光。

当一束白光通过某一有色溶液时，一部分波长的光被吸收，另一部分波长的光则透过。例如，KMn O4溶液吸收绿色的光，透过紫红色的光，因而KMn O4溶液呈现紫红色。当两种光按一定的比例组成白光时，常称这两种光为互补色光，两种颜色互为补色。在可见光区，不同波长的光呈现不同颜色，因此，溶液的颜色由透射光的波长所决定。物质呈现颜色是物质对不同波长的光选择性吸收的结果。以上只是从有色溶液对各种色光选择性吸收来定性说明有色溶液的颜色。一种有色溶液选择性地吸收哪些波长的光，可用有色溶液的光吸收曲线来定量描述。所谓光吸收曲线，就是用不同波长的光照射某一固定浓度和液层厚度的溶液时，测量每一波长下此溶液对光的吸收程度（称为吸光度，用A表示）。

以吸光度A值为纵坐标，相对波长λ的nm值为横坐标，绘制作图，则得到一曲线。这种描述某组分吸光度A值与波长λ（nm）的函数关系曲线，常称为吸收曲线。如图6．7所示吸光度A值最大的曲线就是0．001mol／L的KMn O4溶液对不同波长光的选择性吸收情况。由图6．7可知，KMn O4溶液对525nm的光的吸收最强。在吸收程度最大处的波长称为最大吸收波长，用λmax表示。

不同物质的吸收曲线的形状和λmax也不相同，根据这个特性可用作物质的初步定性分析。

如果溶液的浓度不同，吸光度A值也不同，但吸收曲线形状相同，最大吸收波长λmax不变，可见在最大吸收波长处测定吸光度，其灵敏度最高。因此，吸收曲线是吸光度法选择测定波长及进行初步定性分析的重要依据。如图6．7所示为KMn O4溶液在不同浓度下的吸收曲线。

图6．7 KMn O4溶液的光吸收曲线

6．2．3 光吸收的基本走律

光吸收定律即朗伯-比尔定律，也简称为比尔定律，是由实验事实总结得出的。它定量地说明物质对光的选择性吸收的程度与物质浓度及液层厚度间的关系，是吸光度法定量分析的理论基础。

如图6．8所示，当一束平行单色光通过液层厚度为b（cm）的有色溶液时，I0为入射光强度；It为透射光的强度。溶质吸收了光能，光的强度就要减弱。溶液的浓度越大，通过的液层厚度越大，则光被吸收得越多，光强度减弱也越显著。描述它们之间定量关系的定律称为光的吸收定律。

图6．8 光的吸收示意图

将朗伯定律与比尔定律结合起来，就称为朗伯-比尔定律，可表示为

式中 A——吸光度；

I0——入射光强度；

It——透射光强度；

K——比例常数；

b——吸收池液层厚度（光程长度）；

c——有色溶液的浓度。

其物理意义是，当一束单色平行光照射并通过均匀的、非散射的吸光物质溶液时，溶液中质点的吸光度A与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。

朗伯-比尔定律不仅适用于溶液，也适用于其他均匀非散射的吸光物质（气体或固体）。

在吸光光度法中，有时也用透光率T来表示物质吸收光的能力大小，透光率是透射光强度It与入射光强度I0之比，即

T与A之间的关系为

K值表示单位浓度、单位液层厚度的吸光度，它是与吸光物质性质及入射光波长有关的常数，是吸光物质的重要特征值。

K值的表示方法依赖于溶液浓度的表示方法，在液层厚度b以cm为单位时，系数K的名称、数值及单位均随溶液浓度单位而变。这里介绍两种表示方法：

①浓度以g／L为单位时，将K称为光系数，以a表示，单位为L／（g·cm），即

②浓度以mol／L为单位时，则将系数K称为摩尔吸光系数，以ε表示，单位为L／（mol· cm），即

a与ε的关系为

ε＝Ma

式中 M——吸光物质的摩尔质量。

吸光光度法主要应用于微量和痕量组分的测定，有时也用于某些高含量物质的分析，近年来还用于多组分物质的分析。定量分析方法很多，应根据测定对象和目的加以选择。对于单组分的定量测定，可选择常规定量分析方法；如果测定高浓度溶液，可采用示差分光光度法。

6．2．4 走量分析方法

1）比较法

比较法又称为标准对照法。在最大吸收波长处分别测出试样溶液cx和标准溶液cs的吸光度Ax和As，进行比较即可直接求得样品的浓度。

因为Ax＝εcxb，As＝εcsb，所以

2）标准曲线法

该法用得最为广泛。配制一系列（一般为5～8个）浓度不同的标准溶液，显色后分别在最大吸收波长处测定各自的吸光度，然后以标准溶液浓度为横坐标，以相应的吸光度为纵坐标，绘制A-c工作曲线。如果符合光吸收定律，则可得一条通过坐标原点的直线，如图6．9所示。在相同的条件下测定样品溶液的吸光度Ax，就可从工作曲线上查出对应Ax的浓度cx。在固定仪器和方法的条件下，工作曲线可以长期多次使用，必要时可定期核对，此法常用于工厂中的例行分析。

图6．9 A-c工作曲线

3）标准加入法

标准加入法也称增量法。这里只介绍一次标准加入法。取一份浓度为cx的试液测其吸光度，设为Ax；再取一等份该试液，加入一定量的待测物质的标准溶液使其浓度增加ck，再测其吸光度设为Ax＋k。

因为Ax＝εcxb，Ax＋k＝ε（cx＋ck）b，所以

4）示差分光光度法

当待测组分含量高，溶液的浓度大时，吸光度值往往超出读数的范围，无法直接测定。此时，可采用示差分光光度法。

示差分光光度法是用来测定常量组分的，采用一个比待测试液浓度稍低的标准溶液作为参比溶液，设参比标准溶液浓度为cx，待测试液为cs，且cx＞cs。根据朗伯—比尔定律，可得

吸光度差值与浓度差值成正比关系。这就是示差分光光度法的基本原理。因为是用已知浓度的标准溶液为参比液，在仪器上调试为“零”（T＝100％），故测得的吸光度就是待测试液与参比溶液的吸光度差值（相对吸光度）。此法可测定Mo、W、Ta、Ti、Al、Si O2-3等高含量组分。

示差法在实际应用时受到一定限制，因为使用一定浓度的标准溶液作为参比溶液时，透射光强度减弱，为了调至100％透光度，就必须提高光源强度，增宽狭缝或提高仪器的灵敏度。这样，往往会使光谱通带变宽（单色光纯度变劣），噪声增大，结果造成测定灵敏度下降和工作曲线的线性关系破坏。