荧光偏振免疫分析

荧光偏振免疫分析(Fluorescence Polarization Immunoassay，FPIA)起源于20世纪70年代，它是指用一定波长的激发偏振光照射荧光物质，并利用物质吸收光能后所发射的偏振荧光的强度来测定待测物含量的一种免疫分析方法。1981年Jolley等利用荧光免疫分析技术测定了血清中氨基糖苷类抗生素的含量。雅培公司(Abbott)设计出TDx仪(一种快速测定血药浓度的仪器)，自动化水平高，可以直接测定血药浓度。近年来越来越多的荧光偏振免疫分析仪器和检测手段出现，大大提高了灵敏度，扩大了分析范围。

通常一束一定波长的、向各个方向振动的紫外或者可见光向具有刚性平面的化合物照射时可以产生普通的荧光，而普通紫外或者可见光经特定的偏振器处理后照射具有刚性平面的化合物后则形成偏振荧光。当在样品池和发射单色器后放置一检偏振器即能测出物质的偏振荧光强度。FPIA法通常采用荧光素衍生物例如荧光素异硫氰酸盐、羧基荧光素N－羟基－琥珀酰亚胺酯等来标记药物，使药物具有刚性平面而产生荧光性。其中以荧光素异硫氰酸盐最为常用，可以用它来制备多数荧光标记药物。偏振荧光标记物的制备方法是采用化学手段使荧光素衍生物与药物相连，所得标记药物用485 nm激发光照射后，能产生525～550 nm的偏振荧光。

被测药物偏振荧光强度与其分子旋转速率有关，分子量越小，旋转速度越快，偏振荧光强度越小。这是由于分子量较小时，受激发偏振光照射时产生的荧光难以在同一平面内形成偏振光，而是向不同方向分散，荧光偏振度降低，荧光强度变低。其反应过程可以表示为以下公式:

D－F+—→Ab D－F－Ab

D表示未标记药物，D－F表示标记药物，Ab代表抗体。

图7－8　荧光偏振免疫分析原理示意图

标记药物(D－F)分子量低，因而荧光强度低;当标记药物与抗体结合成为荧光标记复合物(D－F－Ab)时，分子量变大，荧光强度变强。因此，待检抗原含量与偏振荧光强度成反比。FPIA反应机理可以表示为图7－8。

FPIA法绘制标准曲线时，要先计算偏振度［偏振度指的是结合标记药物(D－F－Ab)的偏振荧光强度占均相溶液中偏振荧光总强度的比例］，然后结合血药浓度建立标准曲线。药物的浓度用标准曲线法得出，样品中药物浓度与荧光偏振度呈反比。FPIA法的特点是:样品用量少;荧光素标记试剂稳定，使用寿命长，且安全环保，避免环境污染;检测结果精密度、重复性良好，但是灵敏度较非均相荧光免疫测定法低;快速，易自动化。检测过程仅需样品、示踪剂及抗体加入和混匀，数分钟育温后即可测定，利于大批量样品的分析检测;主要适于小分子量、中等分子量物质检测，对本身分子量很大的物质不适合采用此方法。