荧光显微镜检查注意事项

(一)荧光显微镜标本制作要求

1.载玻片 载玻片厚度应为0.8~1.2mm,太厚吸收光多,另外激发光在标本上的聚焦也不好。载玻片必须光洁,厚度均匀,无明显自发荧光,也可选用石英玻璃载玻片。

2.盖玻片 盖玻片应光洁,厚度在0.17mm左右。为加强激发光,也可用干涉盖玻片。这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长光起干涉作用物质(如氟化镁)的盖玻片,它可以使荧光顺利通过反射激发光。

3.标本 组织切片或其他标本不能太厚,如太厚激发光大部分被标本下部消耗,而物镜直接观察到的上部不能被充分激发。另外,细胞重叠或杂质掩盖使背景非特异染色引起的荧光会影响结果判断。

4.封裱剂 封裱剂必须无色透明,无自发荧光,荧光的亮度在p H9.0~9.5时最强,且不会很快退去,常用的是甘油。一般将常用甘油和0.5mol/L、p H9.0~9.5的碳酸盐缓冲液等量混合配成封裱剂。用抗褪色封裱剂封裱荧光染色标本对显微摄影更有利。配方是将P-次苯基二胺二氢氯100mg加入PBS10ml,调p H至9.0~9.5,再加入甘油90ml,混匀,室温放置过夜,待液体中小气泡完全消失即可使用。

5.油镜 观察标本一般用暗视野荧光显微镜和油镜,镜油最好用特制的无荧光镜油,也可用甘油或液状石蜡代替,只是折光率较低,略影响图像质量。落射光荧光显微镜无需镜油。

(二)荧光显微镜使用注意事项

1.严格按照荧光显微镜出厂说明书要求操作,不可随意改变程序。

2.检测应在暗室进行。进入暗室后,接上电源,点燃超高压汞灯5~15min,待光源发出的强光稳定,眼睛完全适应暗室后,再观察标本。

3.应注意预防紫外线对眼睛的损害,在调整光源时应戴好防护眼镜。

4.检查时间每次以1~2h为宜,超过90min,超高压汞灯发光强度会逐渐下降,荧光减弱;标本受紫外线照射3~5min后,荧光也会明显减弱或褪色;所以观察时间最好不超过2h,最多不能超过3h。

5.荧光显微镜光源寿命有限,标本应集中检查,缩短检查时间,以保护光源。天热时,应散热降温;新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用,必须待灯光充分冷却后才能点燃。应避免一天内数次点燃光源。