＊实验14 分子荧光分光光度法测定面粉中核黄素（维生素B2）
一、目的
学习荧光分析法的基本原理。掌握面粉样品的消解方法和荧光的测定方法，了解荧光分光光度计的主要结构及工作原理，掌握其正确使用方法。
二、内容提要
某些物质经紫外光或波长较短的可见光照射后，会发射出较入射波长更长的荧光。荧光光谱反映了物质的特性。建立在测量荧光光谱基础上的分析方法称为荧光分析法。
对同一物质而言，在稀溶液（即A＝abc＜0.05）中，荧光的强度F与该物质的浓度c有以下关系
式中фf为荧光过程的量子效率，a为荧光分子的吸光系数，b为试样的吸收光程，I0为入射光的强度。当I0及b不变时，上式变为
式中K为常数。
荧光分析法具有灵敏度高（超过分光光度法2～3个数量级）、取样少、方法快速等特点，现已成为食品、生物医药、天然产品、农业、环境保护、化工等领域中的重要分析方法之一。由于许多物质本身不会发生荧光，故在使用范围上受到一定的限制。
维生素B2又名核黄素（Riboflavine，C17H20O6N4），为黄色针状结晶，熔点为282℃，耐热，对空气、氧气稳定，微溶于水，水溶液呈黄绿色荧光。核黄素对光很敏感，在430～440nm蓝光照射下，就会发生绿色荧光，荧光峰值波长为525nm左右。在pH值为6～7的溶液中荧光最强，在pH值为11时荧光消失。在稀溶液中，荧光的强度与核黄素的浓度成正比。利用核黄素这一性质，选择合适的激发波长、荧光波长等实验条件，即可对核黄素进行定量测定。
本实验测定面粉中的核黄素，将面粉在酸性介质的热溶液中提取核黄素，不溶物难以过滤，可先用离心或砂芯漏斗过滤分离，再用滤纸过滤，获得测量用的清液。实验采用标准曲线法，测定核黄素的含量。
三、仪器和试剂
1.仪器
F－4500荧光分光光度计或Cary Eclipse荧光分光光度计（附石英液槽）
离心机（附离心管6个）
真空泵
电子天平（百分之一）
吸量管 5mL1支，1mL1支
容量瓶 25mL 9个，100mL 1个，250mL 1个
烧杯 10mL 2个，100mL 1个，250mL 1个，400mL 1个
量筒 100mL 1个
量杯 10mL 1个
砂芯漏斗和抽滤瓶，三角漏斗，定量滤纸，pH试纸
滴管，洗瓶，洗耳球，玻璃搅棒等
2.试剂
醋酸溶液 （5∶95）：量取5体积冰醋酸，与95体积蒸馏水混合
盐酸溶液 （1∶1）：量取1体积浓盐酸，用1体积蒸馏水稀释
盐酸溶液 0.1mol·L－1：自配300mL（两人合用）
氢氧化钠溶液 5％：称取氢氧化钠固体5g，溶于100mL蒸馏水中（两人合用）
核黄素标准溶液 50μg·mL－1：准确称取核黄素0.0500g，用（5∶95）醋酸溶液溶解，稀释并定容为1L。（水溶液遇光易变质，标准溶液应新鲜配制，其碱性水溶液亦易变质）
市售面粉
四、实验步骤
1.试样溶液的制备
准确称取均匀的面粉样品5～10g（以含核黄素约为5～10μg为宜）于400mL烧杯中，加入0.1mol·L－1盐酸溶液50～100mL，剧烈搅动使成稀薄浆状，将此烧杯置于石棉网上，然后再倒入事先已经煮沸的150mL沸水，不断搅拌并保持煮沸30min以上（建议于121 ～123℃高压釜内加热混合物30min）。若出现块状物，可持续搅动直至颗粒均匀分散。
待冷却后，在剧烈搅动下，用NaOH溶液调节pH至6.0～6.5（因核黄素在碱性溶液中不稳定，所以要边加边摇，防止局部碱度过强而破坏核黄素），然后立即加稀盐酸直至pH约为4.5。
将混合物定量转移至250mL容量瓶中，用（5∶95）醋酸溶液定容（定容时可加1滴丁醇），摇匀。然后用滤纸过滤（若混合物难于过滤，可离心和砂芯漏斗过滤，或先用砂芯漏斗过滤，再用滤纸过滤）。取出一份清晰的滤液（约50mL），避光保存，待测。
2.实验条件的选择
（1）激发光波长和荧光波长的选择
用吸量管准确吸取核黄素标准溶液1.00mL置于25mL容量瓶中，用（5∶95）醋酸溶液稀释至刻度，摇匀。将荧光分光光度计的荧光波长（即发射光波长，EM）暂设定在525nm处，在400～500nm波长范围内对激发波长（即入射光波长，EX）进行扫描，记录激发光谱曲线。
然后将激发光波长设定在其最大峰值处，在500～600nm波长范围内对荧光波长进行扫描，记录荧光光谱曲线。从激发光谱及荧光光谱上确定最佳的激发光波长和最佳的荧光波长。
（2）酸度的选择
取3个25mL容量瓶，各加入核黄素标准溶液1.00mL，然后分别用（1∶1）盐酸、（5∶95）醋酸、5％氢氧化钠溶液稀释至刻度，摇匀后用酸度计或pH试纸测定溶液的pH值，并于荧光分光光度计上测出相应的荧光强度，考察酸度对荧光强度的影响，从中确定最佳酸度的溶液。
3.标准曲线的绘制
准确移取50μg·mL－1核黄素标准溶液1.00mL置于100mL容量瓶中，用2.（2）所确定的最佳酸度的溶液来稀释至刻度，摇匀。然后，再准确移取此核黄素标准溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00及5.00mL分别置于6个25mL容量瓶中，用2.（2）所确定的最佳酸度的溶液来稀释至刻度，摇匀。
在所选定的实验条件下，从稀到浓依次测量各个标准溶液的荧光强度。
4.样品的测定
在与绘制标准曲线相同的实验条件下，测量实验步骤1中所制备得到的面粉试样溶液的荧光强度。
五、数据处理
1）记录核黄素的激发光谱和荧光光谱，并确定最佳的激发光波长和最佳的荧光波长。
2）记录酸度对荧光强度的影响，确定测量的最佳的pH值。
3）记录核黄素标准溶液不同浓度时的荧光强度，绘制标准曲线或拟合出线性方程。
4）记录面粉样品中核黄素的荧光强度，在标准曲线上或由拟合方程求得核黄素的浓度，根据样品取样量和稀释倍数，计算出面粉样品中核黄素的含量（mg·kg－1）。
六、思考题
1.核黄素溶液在保存和测量过程中应注意哪些问题？
2.在荧光测量时，为什么激发光的入射与荧光的接收不在一直线上，而呈一定角度？
3.试述荧光分光光度计与紫外－可见分光光度计在结构上有哪些不同点？
七、附录
1.F－4500荧光分光光度计
（1）结构和原理
日本日立公司生产的F－4500荧光分光光度计是一种典型的人机对话式荧光分光光度计（图4－19）。仪器由主机、计算机工作站和GP－IB通信接口卡组成。主机包括氙灯、样品池室、激发/发射单色器及光电倍增管；模/数转换器与微处理器；激发/发射光路垂直装置。该仪器具有下述功能：①激发/发射波长扫描；②荧光强度测定；④时间扫描；④三维荧光光谱扫描。
F－4500荧光分光光度计主机在计算机工作站的指令下完成所选仪器功能的操作。计算机工作站通过GP－IB通信卡与主机内的微处理器连接，传递运行指令，如设定激发/发射波长；选择单色器狭缝大小；自动开启与关闭光闸等，并采集、处理测定数据。
F－4500荧光分光光度计工作原理，如图4－18所示，氙灯产生的连续光由激发单色器色散出具有一定光谱通带的单色光，照射在样品上，激发后产生的荧光，由发射单色器色散成荧光光谱，并由光电倍增管检测荧光强度，通过模/数转换器转换为数字信导，经主机微处理器、GP－IB通信卡传送到计算机工作站。计算机工作站将收到的数字信号进行处理，由显示器显示数据和谱图。在激发单色器与样品池间设置光束分裂器，将激发单色器色散出的一部分光，由监控检测器检测，检测信号也被输送到模/数转换器，与荧光检测信号比较，以补偿因光源强度波动引起的荧光强度波动。
图4-18 F4500荧光分光光度计工作原理框图
（图中的虚线为光路系统，实线为信号指令系统。）
图4-19 F－4500荧光分光光度计
（2）F－4500荧光分光光度计的使用
1）开机。
①依次开启打印机电源开关，主机总电源（POWER）开关，Xe灯电源（按下不超过5s，黄灯应亮）开关，主电源（MAIN）（绿灯频闪2次至3次后应熄灭）开关，显示器电源开关，计算机电源开关。
②启动FL Solutions Program。双击“FL Solutions Program”图标后，显示FL Solutions Program窗口，仪器进入初始化，在右下角可看到字样“Initializing”。初始化完毕后，窗口右侧会显示一工具条，内含“Method、Sample、STD、Measure、STOP、Close”等功能图标。测量方法（Method）中包括波长扫描、时间扫描、光度测量、三维扫描。
2）波长扫描（Wavelenght Scan）。
操作程序：开始Start→方法设置（点击Method）→样品名（点击Sample）→预扫描（点击Pre－scan）→测量（点击Measure）→数据处理→打印（点击Report）→结束End。
①测量前设置方法（点击右侧工具条中“Method”）。
a.General。点击“General”后，按以下要求进行选择/设定/输入数值或文字。
（a）Measurement测量方式：选择“Wavelength Scan”波长扫描。
（b）Operator操作者：自定。
（c）Sampling取样：选择“Standard”标准品。
b.Instrument。点击“Instrument”后，按以下要求进行选择/设定/输入数值或文字。
（a）Scan mode扫描方式：先选择“Excitation”激发方式，然后再选择“Emission”发射方式。如需同步扫描（见实验15），应选择“Synchronous”（同步方式）。
（b）Data mode数据采集方式：选择“Fluorescence”荧光强度。
（c）激发光谱扫描：选择“Excitation”激发方式后，分别设定“EM WL”发射波长、“EX Start WL”激发起始波长、“EX End WL”激发结束波长的值。
（d）发射光谱扫描：选择“Emission”发射方式后，分别设定“EX WL”激发波长、“EM Start WL”发射起始波长、“EM End WL”发射结束波长的值。
（e）Scan speed扫描速度：一般选择“240nm·min－1”。
（f）Delay延时：选择“0s”。
（g）EX Slit、EM Slit激发和发射狭缝：都选择“5nm”。
（h）PMT Voltage光电倍增管电压：选择“700V”。
（i）Response响应时间：选择“Auto”自动。
（j）Shutter control光闸控制：“√”打勾。
（k）Replicates重复测量次数：选择“1”。
c.Monitor。点击“Monitor”后，按以下要求进行选择/设定/输入数值或文字。
（a）Y－Axis Max/Y－Axis Min Y轴最大值和最小值：分别设定为“1000”（或适当值）和“0”。
（b）Open data processing window after data acquisition：“√”打勾。
（c）Print report after data acquisition：“×”打叉或不选择。
d.Processing。点击“Processing”后，按以下要求进行选择/设定/输入数值或文字。
选择“Savitsky－Golay Smooth”。
e.Report。点击“Report”后，按以下要求进行选择/设定/输入数值或文字。
（a）Output输出方式：不用选择。
（b）Oriention打印报告方式：不用选择。
（c）其他方框内不用选择。
②波长扫描。上述参数设定并确认以后，分别在Excitation激发方式和Emission发射方式下，点击“Measure”，按计算机提示，分别进行激发光谱和发射光谱波长扫描，测量完成以后点击“End”，即可得到包括激发光谱和发射光谱的光谱图及数据。
3）光度测量（Photometry）。
操作程序：开始Start→方法设置（点击Method）→样品名（点击Sample）→测量（点击Measure）→打印（点击Report）→结束End。
①测量前设置方法（点击右侧工具条中Method）。
a.General。点击“General”后，按以下要求进行选择/设定/输入数值或文字。
（a）Measurement测量方式：选择“Photometry”光度测量。
（b）Operator操作者：自定。
（c）Sampling取样：选择“Standard”标准品。
b.Quantitation。点击“Quantitation”后，按以下要求进行选择/设定/输入数值或文字。
（a）Quantitation type定量方法：选择“Wavelength”波长。
（b）Calibration type校正方法：选择“1st order”线性。
（c）Number of wavelengths波长数：选择“1”。
（d）Concentration unit浓度单位：选择“μg/mL”。
（e）Force curve through zero曲线过零：“√”打勾。
（f）Digit after decimal point小数点后位数：选择“3”。
（g）Lower/Upper concentration浓度下上限：分别选择“0”和“1000”（或适当值）。
c.Instrument。点击“Instrument”后，按以下要求进行选择/设定/输入数值或文字。
（a）Data mode数据采集方式：选择“Fluorescence”荧光强度。
（b）Wavelength mode波长方式：选择“Both WL Fixed”或“EX WL Fixed”，分别输入所选定的激发波长“EX WL”峰值波长和发射波长“EM WL”峰值波长。
（c）EX Slit、EM Slit激发和发射狭缝：都选择“5nm”。
（d）PMT Voltage光电倍增管电压：选择“700V”。
（e）Auto statistic cal.自动统计计算次数：选择“3”。
（f）Replicates重复测量次数：选择“1”。
（g）Integration time积分时间：选择“0.1s”。
（h）Delay延时：选择“0s”。
d.Standards。点击“Standards”后，按以下要求进行选择/设定/输入数值或文字。
（a）Number of Samples标准样品个数：输入所配标准样品个数。
（b）Sample标准样品编号：自定，按顺序输入。
（c）Concentrotion标准样品浓度：按顺序输入所配标准样品浓度的数值。
e.Monitor。点击“Monitor”后，按以下要求进行选择/设定/输入数值或文字。
（a）Y－Axis Max/Y－Axis Min Y轴最大值和最小值：分别设定为“1000”（或适当值）和“0”。
（b）Open data processing window after data acquisition：“√”打勾。
（c）Print report after data acquisition：“√”打勾。
f.Report。点击“Report”后，按以下要求进行选择/设定/输入数值或文字。
（a）Output输出方式：选择“Print Report”。
（b）Orientation打印报告方式：选择“Portrait”竖式。
（c）其他方框内√打勾。
②测量。上述参数设定并确认以后，点击“Measure”，按计算机提示，即可进行标准样品和未知样品的测定，测量完成以后点击“End”，即可得到包括标准曲线和数据在内的打印报告。
4）三维扫描（3－D Scan）。
操作程序：开始Start→方法设置（点击Method）→样品名（点击Sample）→预扫描（点击Pre－scan）→测量（点击Measure）→数据处理→打印（点击Report）→结束End。
①测量前设置方法（An Analysis Method）（点击右侧工具条中“Method”）。
a.General。点击“General”后，按以下要求进行选择/设定/输入数值或文字。
（a）Measurement测量方式：选择“3－D Scan”三维扫描。
（b）Operator操作者：自定。
（c）Sampling取样：选择“Standard”标准品。
（d）其他选项可自定或不设置。
b.Instrument。点击“Instrument”后，按以下要求进行选择/设定/输入数值或文字。
（a）Data mode数据采集方式：选择“Fluorescence”荧光强度。
（b）EX Start WL、EX End WL：分别设定激发起始波长、激发结束波长的值。
（c）EM Start WL、EM End WL：分别设定发射起始波长、发射结束波长的值。
（d）EX Sampling Interval激发波长扫描间隔：1～50nm，可设定为“10nm”，不要太小。
（e）EM Sampling Interval发射波长扫描间隔：1～10nm，可设定为“10nm”，不要太小。
（f）Scan speed扫描速度：自定。
（g）EX Slit、EM Slit激发和发射狭缝：都选择“5nm”。
（h）PMT Voltage光电倍增管电压：选择“700V”。
（i）Response响应时间：选择“Auto”自动。
（j）Corrected spectrum校正光谱：不设置。
（k）Shutter control光闸控制：“√”打勾。
c.Monitor。点击“Monitor”后，按以下要求进行选择/设定/输入数值或文字。
（a）Y－Axis Max/Y－Axis Min Y轴最大值和最小值：分别设定为“1000”（或适当值）和“0”。
（b）Open data processing window after data acquisition：“√”打勾。
（c）Print report after data acquisition：“√”打勾。
（d）Contour interval等高线间隔：“10”（或适当值）（范围为：0.01～1000）。
d.Processing。点击“Processing”后，按以下要求进行选择/设定/输入数值或文字。
（a）Integration mode积分方式：选择“rectangular”矩形。
（b）Threshold界限：选择“1”（范围为：0.001～1000）。
（c）Sensitivity灵敏度：选择“1”（范围为：1～8）。
e.Report。点击“Report”后，按以下要求进行选择/设定/输入数值或文字。
（a）Output输出方式：选择“Print Report”。
（b）Oriention打印报告方式：选择“Landscape”。
（c）Contour等高线：选中。
（d）其他方框内“√”打勾。
f.Defining your Sample样品规定。点击“Sample”后，按以下要求进行选择/设定/输入数值或文字。
（a）Sample name样品名、Comment解说：自定。
（b）文件自动保存：“√”打勾。
②Conducting Measurement测量。以上参数设定并确认以后，点击“Measure”，计算机即可绘出样品的三维图像，其中包括Contour line等高线、Excitation spectrum/Emission spectrum激发和发射光谱、Synchronous spectrum同步荧光、Peak table峰波长－峰高表等（可在窗口中View菜单下选择、切换）。
中途暂停测量，可点击“Stop”。
③Displaying a Bird’s－Eye View展示俯视图。点击“Spectrum toolbar”中的“Bird’seye view”后，即可展示俯视图，并可根据需要改变俯视方向，还可显示等高线图（亦可在View菜单下选择、切换）。
④Data Printout打印数据。点击工具条中的“Print”。
⑤End结束工作。测量完成以后，点击“End”，并按规定退出测量程序。
5）关机。
①选择文件菜单中的退出命令，终止“FL Solutions Program”程序，并按规定关闭计算机、显示器、打印机。
②测量完成以后，按以下顺序关机：关闭主电源（MAIN）开关，关闭主机总电源（POWER）开关。
2.Cary Eclipse荧光分光光度计
（1）简介
Cary Eclipse荧光分光光度计由美国瓦里安（Varian）公司生产。可测定荧光、磷光、化学和生物发光。光度计用WINDOWS XP和2000操作系统控制，软件具有扫描、浓度、动力学、时间分辨及仪器校准、性能认证等功能。主机的结构及光路由图4－20示出。
图4-20 Cary Eclipse荧光分光光度计
仪器的闪烁式氙灯光源系统及水平狭缝的光路设计，不仅提高了仪器的灵敏度，而且减少了测定时所需的试样量。
（2）液体试样的测量步骤
1）换上测定液体试样的样品架。
2）打开荧光仪，自检。
3）进入计算机操作系统，点击桌面图标“Scan”运行程序。
4）点击操作界面左上方的“Setup”键，按具体的要求选择Excitation、Emission、Synchronous模式，并进行相应的参数设定，点击“OK”完成设定。
5）点击左上方的“Zero”，系统归零。
6）取一定量的试样于荧光用样品池中，置于样品架中。
7）点击“Start”，为样品输入名称，点击“OK”开始测量。
8）可选择打印结果，选中所需的图谱，“File”→“Print”即可；或者以“＊.csv”格式保存数据，可在Excel中处理，选中所需图谱，“File→Save as”即可。
9）取出试样，退出操作程序，关掉荧光仪，结束实验。
（3）程序中常用的功能简介
1）显示模式，当有多张图谱时，可选择只显示一张图谱或者将所有图谱同时显示在窗口中，操作如下：
“Graph→Single/Multi graph”将所选择的图谱单独显示于窗口。
“Graph→Auto－arrange graph”将所有图谱自动排列于窗口中。
2）坐标选择，系统所预设的刻度范围可能对于显示不够理想，可以自动或手动调整其大小，操作如下：
“Graph→Auto scales”系统会自动调整到系统默认的最合适的刻度范围。
“Graph→Axes scales”手动调整，可以自己定义刻度的范围。
3）标记峰，可以让系统自动寻找峰的位置，读出相应的强度，操作如下：
“Graph→Peak labels”设定一个阈值（Threshold），就可在不同的精度下标记峰。
4）读数，可在图谱的任意位置读取数值，也可以在曲线上读取数值，操作如下：
“Graph→Cursor mode→Free”在图谱的任意位置读取数值。
“Graph→Cursor mode→Track”在曲线上读取数值。
5）滑动鼠标，在操作界面的右下方会出现相应的数值。
6）图形叠加，可以根据需要叠加不同的图谱于同一张谱图上，操作如下：
“Graph→Trace preferences”此时会显示已经测定的各样品名称以及相关信息，在所需叠加的图谱前面打勾，就可以进行叠加。
7）数学变换，可以对相应的图谱进行加、减、乘、除、对数、平方根等运算，运算结果同样以图谱的方式显示，以图谱A扣除图谱B为例，操作如下：
“Graph→Maths”，点击图谱A，点击“Selected trace”，再点击出现的计算器界面中的减号运算符“－”，然后点击图谱B，最后点击计算器界面中的等号运算符“＝”，就会得到两者的差谱。
8）其他。
“Graph→Add label”为图谱添加注释。
“Graph→Graph preferences”为图谱设置参数，比如线形，颜色等。
“Graph→Add new graph/Remove graph”添加新的图/删除图谱等。
注：以上各功能在工具栏中都有相应的按键，可以直接点击，执行相应的功能。
（4）寻找测量的激发波长和发射波长
以某一波长为起始的激发波长，监测某一波长范围内样品的发射图谱，然后以一定的步长增加激发波长，监测同一波长范围内样品的发射图谱，直至到终止的激发波长，完成一轮的测定，这样可以得到激发波长、发射波长、发射强度的三维图谱，据此，判断最佳激发波长和发射波长。第一轮寻找可设定激发波长增量较大的步长值，在确定了激发波长所在的大致范围之后，再减小步长，找到更加精确的激发波长。对于发射图谱，同样可以根据第一轮寻找的结果，判断发射波长所在的范围，这样减小记录的发射波长的范围，可以减少整个寻找过程的时间。
操作：
1）“Setup→Emission”，设定起始的激发波长和发射图谱记录的范围；在“3－D Mode”前打勾，设定终止的激发波长和每次增加的波长值；点击“OK”开始测量。
2）“Graph→Grams 3－D”，就可以得到三维图谱。
［1］Willard H H，Merritt L L，and Dean J A，Instrumental Methods of Analysis，5th ed.New York：Van Nostrand，1974，145
［2］王尊本主编.综合化学实验.北京：科学出版社，2003，389
［3］周同惠主编.国际标准常规分析大全.北京：科学出版社，1998，653
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