植物组织免疫酶和免疫荧光技术

实验二十四　植物组织免疫酶和免疫荧光技术

【实验目的】

掌握植物组织免疫荧光技术的基本原理和一般步骤。

【实验原理】

免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指利用抗原抗体反应在组织细胞原位将带有显色剂标记的特异性抗体与抗原结合，然后通过组织化学的显色反应，对相应抗原进行定性、定位和定量测定的一项技术。这项技术将免疫反应的高度特异性、组织化学显色的可见性结合起来，借助显微镜成像和放大的作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)的含量和分布。

这项技术的基本步骤包括:首先是制备待分析物质的抗体。将组织或细胞中待分析物质提取出来或者是体外合成，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体。其次是制备二抗。用前面产生的第一抗体作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶(常用辣根过氧化物酶)或生物素等进行标记。最后通过抗原抗体反应及显色反应，展示细胞和组织中的化学成分，并在显微镜下观察细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞和组织原位水平确定某些化学成分的分布和含量。

免疫组织化学的应用非常广泛。组织和细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

在免疫组织化学实验中，常常采用石蜡切片或冰冻切片方法获得组织切片。石蜡切片和冰冻切片的方法参见本书的实验三十三和实验三十四。

【实验材料】

拟南芥不同组织部位的冰冻切片。

【实验器材】

低温冷冻切片机，恒温培养箱等。

【药品试剂】

30%过氧化氢，10%山羊血清，PBS缓冲液，生物素标记的二抗，BSA，辣根酶标记链霉卵白素，DAB显色工作液等。

【实验方法】

1.冰冻切片于室温放置30分钟，在4℃丙酮中固定10分钟，然后用PBS缓冲液洗3次，每次5分钟。石蜡切片应首先脱蜡，具体过程参见实验二十一。

2.用3%过氧化氢孵育5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性，然后用PBS缓冲液洗2次，每次5分钟。

3.5%～10%正常山羊血清(血清用PBS缓冲液稀释)封闭，室温下孵育10分钟。

4.倾去血清，滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育1～2小时或4℃过夜。然后用PBS缓冲液冲洗3次，每次5分钟。

5.滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(用含有1% BSA的PBS缓冲液稀释)，37℃孵育10～30分钟;或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10～30分钟。之后用PBS冲洗3次，每次5分钟。

6.滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS缓冲液稀释)，37℃孵育10～30分钟;或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10～30分钟。最后用PBS冲洗3次，每次5分钟。

7.显色剂(DAB或AEC)显色。自来水充分冲洗，复染，封片。