金标记免疫技术

时间：2022-05-11 理论教育版权反馈

【摘要】：金标记免疫技术是以胶体金作为示踪标记物应用于抗原抗体检测的一种新型免疫标记技术。目前应用最广泛的是斑点金免疫渗滤技术和斑点金免疫层析技术。③抗原参照品或抗体阳性对照品。斑点金免疫渗滤技术操作简单、无需特殊检测仪器、试剂稳定、检测结果可以长期保存，已逐渐成为“床边检验”的主要方法之一。斑点金免疫层析技术简称免疫层析技术，是将胶体金标记技术和蛋白质层析技术相结合的以NC膜为载体的快速固相膜免疫分析技术。

三、金标记免疫技术

金标记免疫技术是以胶体金作为示踪标记物应用于抗原抗体检测的一种新型免疫标记技术。目前应用最广泛的是斑点金免疫渗滤技术和斑点金免疫层析技术。

（一）胶体金的一般特性

1.胶体金的结构　胶体金也称金溶胶，是由金盐被还原成金原子后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC1₂^-），外层离子层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。

2.胶体金的特性　①微小胶体金颗粒能稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液。②胶体金颗粒的颜色：不同大小的胶体金颗粒呈色有差别，最小的胶体金（2～5 nm）是橙黄色的，中等大小的胶体金（10～20 nm）是酒红色的，较大颗粒的胶体金（30～80 nm）则是紫红色的。③胶体金颗粒的光吸收性：胶体金颗粒在可见光范围内有一个单一光吸收峰，这个光吸收峰的波长（λ_max）在510～550 nm范围内，且随胶体金颗粒大小而变化，大颗粒胶体金的λ_max偏向长波长，小颗粒胶体金的λ_max则偏于短波长。

知识与技能拓展

胶体金的制备

制备胶体金多采用还原法。氯金酸是主要的还原材料，常用的还原剂有枸橼酸钠、鞣酸、硼氢化钠等。根据还原剂类型以及还原作用的强弱，可以制备0.8～150 nm不等的胶体金。最常用的制备方法为柠檬酸盐还原法。具体操作方法如下：①将氯金酸先配制成0.01％水溶液，取100 mL加热至沸。②搅动下准确加入一定量的1％柠檬酸三钠水溶液。③继续加热煮沸15 min，观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸三钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。④冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。用此法可制备16～147 nm粒径的胶体金，金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。

（二）斑点金免疫渗滤技术

【原理】

斑点金免疫渗滤技术（dot immunogold filtration assay，DIGFA）的基本原理是以NC膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成（图6-24）。阳性反应在膜上呈现红色斑点。目前常用双抗体夹心技术检测抗原。

【试剂与器材】

（1）成品试剂盒的组成包括：①滴金反应板，由塑料小盒、吸水垫料和点加了抗原或抗体的NC膜片三部分组成。②胶体金标记物和洗涤液。③抗原参照品或抗体阳性对照品。

（2）待测标本。

图6-24　DIGFA渗滤装置及操作示意

【操作方法】

（1）将反应板平放于实验台上，于小孔内滴加洗涤液湿润NC，渗滤结束后，再滴加血清标本1～2滴，待完全渗入。

（2）于小孔内滴加免疫金复合物试剂1～2滴，待完全渗入。

（3）于小孔内滴加洗涤液2～3滴，待完全渗入，洗去未结合的胶体金标记抗体。

【结果判断】

在膜中央有清晰的淡红色斑点显示者判为阳性反应；反之，则为阴性反应。斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度。

【注意事项】

（1）血清标本应尽可能新鲜。溶血、反复冻融会影响实验结果。

（2）试剂盒应获国家食品药品监督管理局批准文号并在有效期内使用。

【临床应用】

斑点金免疫渗滤技术操作简单、无需特殊检测仪器、试剂稳定、检测结果可以长期保存，已逐渐成为“床边检验（point of care test，POCT）”的主要方法之一。但本检测技术的灵敏度不高，只能作为定性或半定量试验。目前主要用于正常体液中不存在的物质（如传染病抗原、抗体以及毒品类药物等）和正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质（如HCG等）的检测。

（三）斑点金免疫层析技术

斑点金免疫层析技术（dot immunogold chromatographic assay，DICA）简称免疫层析技术（immunochromatographic assay，ICA），是将胶体金标记技术和蛋白质层析技术相结合的以NC膜为载体的快速固相膜免疫分析技术。

【原理】

将各种反应试剂分点固定在试纸条上，试剂条上端（A）和下端（B）分别粘贴吸水材料，免疫金复合物干片粘贴在近下端（C）处，紧贴其上为NC膜条。NC膜条上有两个反应区域，测试区（T）包被有特异抗体，控制区（R）包被有抗-IgG（图6-25）。

将待检标本滴加在试纸条的一端，通过层析作用使样品泳动，样品中的待检物与试纸条中的试剂发生特异性的结合，所形成的复合物被固定在层析条的特定区域，通过标记免疫技术显色。目前常用双抗体夹心技术检测抗原。