技术标记和分选策略

成功进行磁性细胞分选的一个最重要参数是标记质量。应用MACS技术，阳性细胞的标记要求达到最低背景染色，阳性细胞和阴性细胞之间、磁性标记和非磁性标记成分之间，要有明显的区别。MACS技术提供了不同标记策略和分选策略。

直接磁性标记是最快速的磁性标记方法。由于特异性抗体直接与磁性颗粒耦联，因此仅需一个标记步骤。直接标记减少了洗涤次数，从而避免了不必要的细胞丢失。为了降低背景，优化分选，Miltenyi　Biotec选用了高度特异性的单克隆抗体，识别各种属细胞的表面标志，如人、小鼠和大鼠以及非人类灵长类细胞。荧光素结合的MACS抗体可用来做磁性分选细胞的流式细胞仪分析或荧光显微镜观察。

间接磁性标记是当不能进行直接磁性标记时的一种方便的替代办法。直接针对任何种属任何细胞表面标志的高度特异性单克隆抗体或多克隆抗体均可用于间接磁性标记。一抗可以是未结合的、生物素化的或荧光素结合的抗体。第二步是用抗免疫球蛋白微珠、抗生物素微珠或者抗荧光素微珠进行磁性标记。想要同时分选或去除多种类型的细胞，可以选用抗体混合物作为一抗。由于抗半抗原抗体有将磁性标记放大的作用，因此，在磁性分选弱表达标志时，间接磁性标记是一种可以选择的方法。

1．阳性分选（positive　selection）　是指目的细胞被磁性标记后，作为阳性细胞成分被直接分选出来，具有高纯度、高回收率和操作迅速的特点。阳性分选是从异源性细胞悬液中分选靶细胞的最直接、最特异的方法。将细胞滞留在分选柱上只需要少量MACS微珠，通常不会影响细胞的活力或者功能。标记和未标记的组分均可回收，并用于后续实验。由于MACS微珠由氧化铁和多聚糖组成，可以生物降解，一般情况下细胞培养几天后即可消失。

2．去除分选（depletion）　是把非目的细胞磁性标记，从起始细胞混合物中去除。去除分选中，靶细胞是未磁性标记（或者未用抗体标记）的。去除分选策略适用范围包括去除不需要的细胞（非目的细胞）；缺乏针对目的细胞的特异性抗体；不需要抗体和目的细胞表面抗原结合；需进一步通过阳性选择分选特异性细胞亚群。一次去除分选几乎可将所有磁性标记细胞去除，留下高纯度的未标记细胞组分。MACS技术的去除率可高达4个对数级。对于许多类型细胞，Miltenyi　Biotec均可提供优化的MACS试剂盒，这些试剂盒含有预先做好浓度滴定的、直接针对非目的细胞的抗体混合物。

MACS分选策略包括对细胞亚群去除后再阳性分选和多重分选技术分选细胞亚群。

细胞亚群的分选，可以先去除非目的细胞，再磁性标记和阳性分选细胞亚群。如果在细胞悬液中，非目的细胞也表达用来阳性选择目的细胞的抗原，这种策略就非常有用。此外，该方法还可以用来分选非常稀有的细胞，先从起始细胞悬液中去除非目的细胞，再进行阳性分选。

用MACS多重分选试剂盒可以快速、简便地把具有多重表面标志的大量细胞分选出来，甚至非常稀有的细胞也可以被有效地富集。用MACS多重分选试剂盒进行多参数分选，可以顺次进行细胞的阳性分选。首先用MACS多重分选微珠标记靶细胞，做第一参数的阳性分选。然后把分选出的细胞与多重分选解离试剂共孵育，通过酶反应把微珠从抗体上解离。下一步，用直接针对特异性亚群标志的第二种MACS微珠磁性标记细胞。分选即可得到细胞亚群。