胶体金标记检测技术

第三节　胶体金标记检测技术

1971年Faulk和Taytor将胶体金应用于免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。Muller等（1980）应用该技术对牛痘病毒进行了免疫电镜研究，Geoghegan等（1980）和Leuvering等（1981）应用胶体金进行了被动凝集试验，Leuvering等（1983）利用胶体金做了人妊娠诊断研究，Manara等（1984）用过氧化物酶和金染色进行了细胞膜双标记的免疫电镜研究，Wybran等（1985）应用金染色对淋巴细胞亚群做了计数研究。

目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法和快速免疫金渗滤法（DIGFA），用于检测HBsAg、HCG和抗双链DNA抗体等，具有简单、快速、准确和无污染等优点。

免疫胶体金技术的基本原理是氯金酸（HAuCl₄）在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金是负电荷的疏水胶，其颗粒是单个散在的，直径从几纳米到几十纳米不等，呈橘红色。在电解质中，胶体金是不稳定的，除非首先用巨分子（如蛋白质）将胶体金包被起来。用蛋白质包被胶体金，方法简便，速度快，而且重复性好。另外，由于胶体金颗粒呈橘红色，有利于肉眼观察。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。

胶体金检测技术原理示意图

金标过程中，无共价键形成，是一定离子浓度下的物理吸附。因此几乎所有的大分子物质都可被金标记，标记后大分子物质活性不发生改变。实验结果表明，胶体金的敏感性可达到ELISA的水平。而结合银染色时，检测的敏感性更大大提高。胶体金具有很高的动力学稳定性，在稳定因素不受破坏时自身凝聚极慢，可放置数年不发生凝聚。影响稳定的因素主要有电解质、溶胶浓度、温度、非电解质等。

胶体金取代传统三大标记物，用于肉眼水平的免疫检测中。除了胶体金本身具有的特点外，还有以下优点：①试剂和样本用量极小，样本量可低至1～2μl；②不需γ－计数器、荧光显微镜、酶标检测仪等贵重仪器，更适于现场应用；③没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质参与；④实验结果可以长期保存；⑤时间大大缩短，提高了检测速度。

免疫层析原理图

检测抗原及抗体试纸条判断标准

免疫层析法是一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。

目前使用的试纸条有检测抗原或抗体的两种。其基本原理都是夹心法。夹心法测抗体：固定于膜上的鼠疫F₁抗原＋标本中的相应抗体＋金标记的抗原显色。夹心法测抗原：固定于膜上的单克隆抗体＋标本中待测抗原＋金标记的另一株单克隆抗体显色。

操作方法也十分简单。一般的操作方法是在试纸条的上样口处滴加100～200μl样品；也可以将上样口直接插入标本中，深度10～15mm，20s，取出后平放，这种方法比较麻烦且容易造成污染而不推荐使用。

加样15min后可以判断结果。将上样口放置左侧，会看到右侧窗口内靠右的质控带显色，如果靠左处显示条带，则判为阳性，无条带为阴性。前者为检测抗体的试纸条的实验结果，后者为抗原的。

使用试纸条时必须注意保存温度，试纸条虽然可在室温保存，但大批暂时不用的试纸条还是应该放在4℃保存，以免抗体失效，从冰箱刚取出的试纸条则应待其恢复至室温，然后才打开密封，可避免反应线模糊不清。

但目前鼠疫金标—抗体检测中，目前还不能对全血样本直接检测，需在血清分离后才能检测。下一步可考虑在检测条上加滤膜首先对全血成分进行滤过，然后检测。

【注意】

在鼠疫免疫金标—抗原检测中，应尽可能将待检的可疑菌株培养在37℃的条件下、24h后再进行检测。因为体外培养条件下，鼠疫菌F₁抗原的最大量合成是在37℃，而在低于28℃的条件下几乎不能合成及表达。也不能对蚤样本直接进行检测，因为在蚤体内的鼠疫菌不合成F₁抗原。