抗原抗体反应及免疫标记技术

一、酶联免疫吸附试验的原理

酶联免疫吸附试验(ELISA)的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。在测定时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度。

二、ELISA的类型

ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3个必要的试剂:①固相的抗生素原或抗体,即免疫吸附剂(immunosorbent)。②酶标记的抗原或抗体,称为结合物(conjugate)。③酶反应的底物。

根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型。

1.双抗体夹心法测抗原 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下。

(1)将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。

(2)加受检标本,保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。

(3)加酶标抗体,保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。

(4)加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色,测知标本中抗原的量。在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如乙肝表面抗原(HBs Ag)、乙肝e抗原(HBeAg)、甲胎蛋白(AFP)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,做一步法检测。

在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成“夹心复合物”。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同,如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此,在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如,血清中HBs Ag、AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。

双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心。

2.双抗原夹心法测抗体 反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此,其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法。

3.间接法测抗体 间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固相抗原结合的受检抗体,故称为间接法。操作步骤有如下几点。

(1)将特异性抗原与固相载体联结,形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。

(2)加稀释的受检血清,保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合,形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后,固相载体上只留下特异性抗体,血清中的其他成分在洗涤过程中被洗去。

(3)加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体,但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗抗体结合,从而间接地标记上酶。洗涤后,固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。

(4)加底物显色。本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。

间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果,但应尽可能予以纯化,以提高试验的特异性。

4.竞争法测抗体 当抗原材料中的干扰物质不易除去或不易得到足够的纯化抗原时,可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多,结合在固相上的酶标抗体越少,因此,阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的,可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质,直接包被不易成功,可采用捕获包被法,即先包被与固相抗原相应的抗体,然后加入抗原,形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质,然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式,可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合,抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合,洗涤后再加入酶标抗体,与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。

5.竞争法测抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可做夹心法的两个以上的位点,因此,不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少,最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

6.捕获包被法测抗体 Ig M抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定Ig M抗体,因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体,后者将竞争结合固相抗原而使一部分Ig M抗体不能结合到固相上。因此,如用抗人Ig M作为二抗,间接测定Ig M抗体,必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理,以除去IgG的干扰。在临床检验中测定抗体Ig M时多采用捕获包被法。先用抗人Ig M抗体包被固相,以捕获血清标本中的Ig M(其中包括针对抗原的特异性Ig M抗体和非特异性的Ig M)。然后加入抗原,此抗原仅与特异性Ig M相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用,呈色即与标本中的Ig M成正相关。

三、ABS-ELISA法

ABS为亲和素(avidin)、生物素(biotin)、系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白,分子量60 000,每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物,分子量244。用化学方法制成的衍生物素——羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物,标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性,其亲和力较抗原抗体反应大得多,两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与4个生物素分子结合,因此,如把ABS-ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素(LAB)法和桥联亲和素-生物素(ABC)法两种类型。两者均以生物素标记的抗体(或抗原)代替原ELISA系统中的酶标抗体(抗原)。在LAB中,固相生物素先与不标记的亲和素反应,然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期,亲和素从蛋清中提取,这种卵亲和素为碱性糖蛋白,与聚苯乙烯载体的吸附性很强,用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点,在ELISA应用中有替代前者的趋势。由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂,增加了操作步骤,在临床检验中ABS-ELISA应用不多。

四、化学发光免疫分析技术

化学发光免疫分析技术(CLTA)是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合,藉以检测抗原或抗体的分析技术。1978年Schrpeder在RIA和EIA基本理论的基础上,以化学发光信号示踪,建立了化学发光免疫分析技术。发展至今已经成为一种成熟的、先进的超微量活性物质检测技术。主要的优点是灵敏度高、特异性强、标记物稳定、线性范围宽、检测速度快、无放射性污染等。以全自动微粒子酶放大化学发光免疫分析系统为例,该系统以碱性磷酸酶标记抗原或抗体,用3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷酸酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)作为化学发光剂,这种化学发光剂发光稳定、持续时间长,因此,比闪烁发光容易控制。采用磁性微粒子包被技术,由于磁粒子体积小,最大限度扩大了包被面积,可以吸附更多的抗原或抗体,同时磁粒子的核心是铁,在磁场中下沉快,很容易进行洗涤和分离,大大提高了检测速度。化学发光免疫分析技术在目前的临床应用已非常成熟,有取代放射免疫分析技术而成为诊断市场上的主流产品的趋势。但仍存在国外的化学发光免疫分析检测系统价格昂贵,难以得到普及,国内的化学发光免疫分析检测系统虽然价格较国外产品便宜很多,但灵敏度和检测的可靠性得不到保证之不足。

原理:某些化合物分子吸收化学能后,被激发到激发态,再由激发态返回至基态时,以光量子的形式释放出能量,这种化学反应称为化学发光反应,利用测量化学发光强度对物质进行分析测定的方法称为化学发光分析法。

化学发光现象通常出现在放热化学反应中,包括激发和发光两个过程,即:A+b→C* +D、C*→C+hv。

式中,A和B为反应物;C*为激发态产物;D为其余产物;h为普朗克常数;v为发射光子的频率。

化学发光反应可在液相、气相、固相中进行。液相化学发光多用于天然水、工业废水中有害物质的测定。例如,鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰环肼)与过氧化氢在CO2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+等金属离子催化下发生化学发光反应,当鲁米诺与过氧化氢过量时,发光强度与金属离子的浓度成正比,可用于测定痕量金属离子。气相化学发光反应主要用于大气中NO、SO2、H 2 S等气态有害物质的测定。

化学发光分析法的特点是灵敏度高,可达10-3 mg/L,甚至更低;选择性好,对于多种污染物质共存的大气,通过化学发光反应和发光波长的选择,可不经分离就有效地进行测定;线性范围宽,通常可达5～6个数量级。为此,在环境监测、生化分析等领域得到较广泛的应用。

五、电化学发光免疫测定

(一)概念

电化学发光免疫测定(electrochemiluminescence immunoassay,ECLI)。ECLI是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术。电化学发光法源于电化学法和化学发光法,而ECLI是电化学发光(ECL)和免疫测定相结合的产物,是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应,包括了电化学和化学发光两个过程。ECLI不仅可以应用于所有的免疫测定,而且还可用于DNA/RNA探针检测。

(二)反应底物

三氯联吡啶钌{[Ru(bpy)3]2+}络合物。

钌(ruthenium,Ru),原子序数44,原子量101.07。元素名来自拉丁文,原意是“俄罗斯”。1827年俄国化学家奥赞在铂矿中发现钌;1844年俄国化学家克劳斯肯定它是一种新元素。钌在地壳中的含量约为十亿分之一,是铂系元素中含量最少的一个。钌常与其他铂系元素一起分散于冲积矿床和砂积矿床中。钌有7种天然稳定核素:钌96、98、99、100、101、102、104。

钌为银白色金属,熔点2310℃,沸点3900℃,密度12.37×103/m3。

钌的化学性质不活泼,在空气和潮湿环境中稳定;不溶于酸和硝基盐酸,溶于熔融的强碱、碳酸盐、氰化物等;加热到900℃时能与氧反应;加热时能与氟、氯、溴反应;钌有形成配位化合物的强烈倾向,还有良好的催化性能。

钌是铂和钯的有效硬化剂;金属钛中加入0.1%的钌就可大大提高耐腐蚀性;钌钼合金是一种超导体;含钌的催化剂多用于石油化工。

(三)反应原理

1.电化学反应过程 在工作电极上(阳极)加一定的电压能量作用下,二价的三氯联吡啶钌释放电子发生氧化反应而成为三价的三氯联吡啶钌,同时,电极表面的三丙胺(TPA)也释放电子发生氧化反应而成为阳离子自由基TPA+,并迅速自发脱去一个质子而形成三丙胺自由基TPA,这样,在反应体系中就存在具有强氧化性的三价的三氯联吡啶钌和具有强还原性的三丙胺自由基TPA。

2.化学发光过程 具有强氧化性的三价的三氯联吡啶钌和具有强还原性的三丙胺自由基TPA发生氧化还原反应,结果使三价的三氯联吡啶钌还原成激发态的二价的三氯联吡啶钌,其能量来源于三价的三氯联吡啶钌与三丙胺自由基TPA之间的电势差,激发态[Ru (bpy)3]2+以荧光机制衰变并以释放出一个波长为620nm光子的方式释放能量,而成为基态的[Ru(bpy)3]2+。

3.循环过程 上述化学发光过程后,反应体系中仍存在二价的三氯联吡啶钌和三丙胺,使得电极表面的电化学反应和化学发光过程可以继续进行,这样,整个反应过程可以循环进行。

通过上述的循环过程,测定信号不断放大,从而使检测灵敏度大大提高,所以ECL测定具有高灵敏的特点。

(四)免疫原理

上述的电化学发光过程产生的光信号的强度与二价的三氯联吡啶钌的浓度呈线性关系。

将二价的三氯联吡啶钌与免疫反应体系中的一种物质结合,经免疫反应、分离后,检测免疫反应体系中剩余二价的三氯联吡啶钌经上述过程后所发出的光,即可得知待检物的浓度。

电化学发光免疫分析(ECLIA)是20世纪90年代发展起来的一种新型发光方法,是电化学发光和免疫测定相结合的产物。一经问世就以发光标记物不需要催化剂、自然本底低、受外界因素干扰少、重现性好、快速、稳定等优点,成为目前最有发展前途的一种免疫分析方法。与化学发光不同的是它在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应,包括了电化学和化学发光两个过程。

由于电化学发光标记物不同,一般化学发光不稳定,为间断的、闪烁性发光,而电化学发光为电促发光,可产生高效、稳定的连续发光,每秒几十万次的循环电化学发光大大提高了分析的灵敏度。而且检测采用均相免疫测定技术,不需将游离相与结合相分开,从而将检测步骤大大简化,明显提高了检测速度。不足的是试剂价格高,国内中小医院及基层单位难以开展。

化学或电化学发光免疫分析,由于其原理新颖,干扰因素少,灵敏度高,准确性好,检测速度快,在内分泌、激素、血浆特种蛋白、肿瘤标志物、传染性标志物、维生素、体内药物浓度等的快速检测中起着重要作用。

六、时间分辨荧光免疫分析法

(一)简介

时间分辨荧光免疫分析法(time resolved fluoroimmuno assay,TRFIA)是近十年发展起来的非核素免疫分析技术,是目前最灵敏的微量分析技术,其灵敏度高达10-12 g/ml,较放射免疫分析高出3个数量级。它用镧系元素标记抗原或抗体,根据镧系元素螯合物的发光特点,用时间分辨技术测量荧光,同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨,可有效地排除非特异荧光的干扰,极大地提高了分析灵敏度。由于其高灵敏度,在临床上得到了广泛的应用,逐渐代替了放射免疫分析。

在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光,因此,使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。大部分背景荧光信号是短时存在的,因此,将长衰减寿命的标记物与时间分辨荧光免疫技术相结合,就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。

时间分辨荧光免疫分析法实际上是在荧光分析(FIA)的基础上发展起来的,它是一种特殊的荧光分析。荧光分析利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外-可见分光光度分析法中杂色光的影响;同时,荧光分析与普通分光不同,光电接受器与激发光不在同一直线上,激发光不能直接到达光电接受器,从而大幅度地提高了光学分析的灵敏度。但是,当进行超微量分析的时候,激发光的杂散光的影响就显得严重了。因此,解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。

解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。但普通的荧光标记物荧光寿命非常短,激发光消失,荧光也消失。不过有非常少的稀土金属(Eu、Tb、Sm、Dy)的荧光寿命较长,可达1～2ms,能够满足测量要求,因此,产生了时间分辨荧光分析法,即使用长效荧光标记物,在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法。平时常用的稀土金属主要是Eu(铕)和Tb(铽),Eu荧光寿命1ms,在水中不稳定,但加入增强剂后可以克服;Tb荧光寿命1.6ms,水中稳定,但其荧光波长短、散射严重、能量大、易使组分分解,因此,从测量方法学上看Tb很好,但不适合用于生物分析,故Eu最为常用。

由于常用Eu作为荧光标记,因此,增强剂就成了试剂中的重要组成。增强剂原理是利用含络合剂、表面活性剂的溶液的亲水和亲脂性同时存在,使Eu在水中处于稳定状态。现在有些试剂,络合Eu在抗体上时已考虑了增强问题,而使用了具有增强作用的新络合剂,因而有的试剂没有单独的增强剂。

随着检验医学的发展,对微量、超微量的测定会越来越多,同时RIA的污染问题会越来越被重视,因此,时间分辨荧光免疫分析法具有越来越大的应用空间,见表2-1。

表2-1 TRFIA技术为临床检测带来的先进性

(二)划时代的检测技术

放射免疫分析(RIA),以其高度特异性灵敏度和实用性,吸引着各国的生物医学工作者,但操作中始终存在放射性污染、核素半衰期短及试剂盒稳定性问题。为此,人们发展了一系列非放射性标记技术,如酶标记、化学发光、生物发光标记等技术,其中,时间分辨荧光免疫分析技术。由于灵敏度及线性范围明显优于其他技术,最为引人注目。

时间分辨荧光免疫分析法是以稀土离子标记抗原或抗体、核酸探针和细胞等为特征的超灵敏度检测技术,它克服了酶标记物的不稳定,化学发光仅能一次发光且易受环境干扰,电化学发光的非直接标记等缺点,使非特异性信号降低到可以忽略的程度,达到了极高的信噪比,从而大大地超过了放射性核素所能达到的灵敏度,且还具有标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点,成为继放射免疫分析之后标记物发展的一个新里程碑。

(三)标记物

采用镧系元素(铕、钐、镝、铽)进行原子标记,较碱性磷酸酶、吖啶酯、生物素等大分子标记物优势明显;原子标记,标记物更多,检测更灵敏,对被标记物的生物活性和结构无影响;原子标记,标记稳定性强;多种标记,一个测试,多个项目。

(四)检测特点

标记离子的荧光激发光波长范围较宽,发射光谱峰范围窄,是类线光谱,有利于降低本底荧光强度,提高分辨率。

激发光和发射光之间有一个较大的Stokes位移,有利于排除特异荧光的干扰,增强测量的特异性。

标记离子螯合物产生的荧光强度高,寿命长,有利于消除样品及环境中荧光物质对检测结果的影响。每1秒检测样品1000次,结果取平均值,有利于提高检测的准确性。

(五)检测参数

灵敏度:10-18 mol/well(Eu3+)

线性度:10-18～10-12 mol/well(Eu3+)

(六)应用

1.激素为甲状腺激素、甾体类激素。

2.病毒性肝炎标记物。

3.肿瘤相关抗原。

4.药物。

5.多肽类。

七、聚合酶链反应

1.聚合酶链反应(PCR)技术的基本原理 该技术是在模板脱氧核糖核酸(DNA)、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下,依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板,借助一小段双链DNA来启动合成,通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合,形成部分双链。在适宜的温度和环境下,DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3′-OH末端,并以此为起始点,沿模板5′→3′方向延伸,合成一条新的DNA互补链。PCR反应的基本成分包括模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(d NTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸3个基本反应步骤构成。

(1)模板DNA的高温变性、模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应做准备。

(2)模板DNA与引物的低温退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

(3)引物的适温延伸:DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以d NTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性-退火-延伸3个过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成1个循环需2～4min,2～3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

2.PCR的反应动力学 PCR的3个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y=(1+x)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平均每次的扩增效率,n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”,这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素。大多数情况下,平台期的到来是不可避免的。

3.PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在2个引物链5′端之间,是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的,以一个原始模板为例,在第一个反应周期中,以两条互补的DNA为模板,引物是从3′端开始延伸,其5′端是固定的,3′端则没有固定的止点,长短不一,这就是“长产物片段”。进入第2周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时,由于新链模板的5′端序列是固定的,这就等于这次延伸的片段3′端被固定了止点,保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内,形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加,而“长产物片段”则以算术倍数增加,几乎可以忽略不计,这使得PCR的反应产物不需要再纯化,就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。

八、生物传感器技术

生物传感器是指能感应规定的被测量,并按一定的规律将其转换成可用信号输出的器件或装置。它一般由两部分组成,其一是由具有对生物或化学分子识别能力敏感材料的识别元件(或感受器)组成;其二是信号转换器(换能器),主要是由电化学或光学检测元件组成。生物传感器技术被列为21世纪五大临床检验技术之一,是现代生物学、化学、医学、材料学和电子学等多学科交叉结合的产物。生物传感器具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在复杂环境中进行在线连续监测的特点,由于自身的优越性,近几十年得到迅速发展并在医学领域得到了广泛的研究与应用。

九、免疫胶体金技术

胶体金是一种常用的标记技术。其基本原理是氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下,可聚合成一定大小的金颗粒,由于静电作用而成为稳定的胶体状态,故称胶体金。胶体金标记,实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。用还原法制备成各种不同粒径、不同颜色的胶体金颗粒,对蛋白质有很强的吸附功能,可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清清蛋白等非共价结合,因而在基础研究和临床试验中成为非常有用的工具。目前免疫胶体金技术应用较广的主要是两种技术,即免疫层析试验及斑点免疫渗滤试验。

胶体金标记技术是继放射免疫分析、荧光免疫分析、酶免疫分析(EIA)三大标记技术之后,又一较为成熟且已得到广泛应用的免疫标记技术。其主要特点是灵敏度较高,操作简单,由于省略了温育过程,因而检测更加快速。不需特殊设备,且可单份测定,特别受到基层的欢迎。但是只能定性,不能定量,核现象可使结果偏低,甚至出现假阴性;严重溶血、黄疸、脂血标本对结果判断有干扰。随着金标技术的不断推广和应用,各种形式的检测条、卡将广泛使用,应特别注意试剂的质量控制。

十、生物芯片技术

生物芯片又称微阵列(microarray),是20世纪末在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术,包括基因芯片、蛋白芯片及芯片实验室3个领域。它主要是指通过微加工技术和微电子技术在固相载体芯片表面构建的微型生物化学分析系统,以实现对核酸、蛋白质、细胞、组织以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。由于生物芯片能够在短时间内分析大量的生物分子,快速准确地获取样品中的生物信息,效率是传统检测手段的成百上千倍,因此,有人认为它将是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。由于生物芯片技术在疾病筛查和早期诊断上具有优势,已经成为检验医学发展的热点之一。目前,通过基因芯片进行细菌检测和细菌耐药性分析,通过蛋白芯片在肿瘤、自身抗体、结核等疾病的筛查和检测方面的检验产品日臻成熟。

综上所述,21世纪将是人类历史上科学技术突飞猛进的时代,免疫学检验作为检验医学中发展最快、最活跃的学科也将进入一个快速发展的新时期。

十一、免疫层析法

免疫层析法(immunochromatography)是近几年来国外兴起的一种快速诊断技术,其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带,当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品(尿液或血清)后,由于毛细管作用,样品将沿着该膜向前移动,当移动至固定有抗体的区域时,样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合,若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色,从而实现特异性的免疫诊断。

十二、常用几种免疫方法的比较

用荧光素、核素或酶标记抗体或抗原,用于抗原或抗体检测是目前广泛应用的敏感、可靠的方法。上述3种常用的标记物与抗原或抗体化学连接之后不改变后者的免疫特性。本方法可用于定性、定量或定位检测。

免疫荧光技术

免疫荧光技术(immunofluorescence technique)是用化学方法使荧光素标记的抗体(或抗原)与组织或细胞中的相应抗原(或抗体)结合,进行定性定位检查抗原或抗体的方法。

1.直接荧光法 把荧光抗体加到待检的细胞悬液、细胞涂片或组织切片上进行染色,经抗原抗体反应后,洗去未结合的荧光抗体,将待检标本在荧光显微镜下观察,有荧光的部位即有相应抗原存在。此法可用于病毒感染细胞、带某种特异抗原的细胞(如T细胞和B细胞)或病原菌的检查,也可用于组织中沉着的免疫复合物的检查。本法的缺点是检查多种抗原,就需分别制备相应的多种标记抗体。

2.间接荧光法 可克服直接法需制备多种荧光抗体的复杂操作。将组织或细胞上的抗原直接与相应抗体(不标记荧光)结合,此为第1抗体,再把能与第1抗体特异结合的荧光标记的抗免疫球蛋白抗体加入,此为荧光标记的第2抗体,观察结果与直接法相同。间接法比直接法敏感性高,如果用于检查抗原的第一抗体是人或动物的只需制备一种抗人或动物的免疫球蛋白荧光抗体。免疫荧光技术在传染病诊断上有广泛的用途,如在细菌、病毒、螺旋体感染的疾病,检查抗原或抗体,如查出Ig M抗体,可作为近期接触抗原的标志,所以使用荧光标记抗Ig M可诊断近期感染。除微生物学方面的应用外,还可利用单克隆抗体鉴定淋巴细胞的亚类。使用流式细胞仪(fluorescene-activated cell sorting,FACS),能自动检测细胞的大小、荧光强度。针对细胞表面不同抗原,可以使用两种不同的荧光染料,如用异硫氰荧光素(FITC)发黄绿荧光,用罗丹明(TMRITC)发红色荧光。由于荧光颜色不同标记两种不同的抗体,对同一细胞进行双标记染色。这种方法对淋巴细胞亚类鉴定起着巨大推动作用。间接荧光法也用于自身免疫病的抗核抗体检查。

3.放射免疫分析法 应用竞争性结合的原理,应作放射性核素标记抗原(或抗体)与相应抗体(或抗原)结合,通过测定抗原抗体结合物的放射活性判断结果,本方法可进行超微量分析,敏感性高,可用于测定抗原、抗体、抗原抗体复合物。本法常用的核素有125Ⅰ和131Ⅰ。

放射免疫分析常用的有液相法和固相法两种。

(1)液相法:将待检标本(如含胰岛素抗原)与定时的核素标记的胰岛素(抗原)和定时的抗胰岛素抗体混合,经一定作用时间后,分离收集抗原抗体复合物及游离的抗原,测定这两部分的放射活性,计算结合率。在反应系统中,待检标本的胰岛素抗原与核素标记的胰岛素竞争性与胰岛素抗体结合。非标记的抗原越多,标记抗原与抗体形成的复合物越少。非标记抗原含量与标记抗原抗体复合物的量呈一定的函数关系。预先用标准的非标记抗原做成标准曲线后,即可查出待检标本中胰岛素的含量。

(2)固相法:将抗原或抗体吸附到固相载体表面,然后加待检标本,最后加标记抗体。测定固相载体的放射活性,常用的固相载体有溴化氰(CNBr)海豹化的纸片或聚苯乙烯小管。放射免疫分析法应用范围广泛,包括多种激素(胰岛素、生长激素、甲状腺素等)、维生素、药物、IgE等。

4.酶联免疫分析法(enzyme immunoassay,EIA) 是当前应用最广泛的免疫检测方法。本法将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来,根据酶作用底物后显色,以颜色变化判断试验结果,可经酶标测定仪做定量分析,敏感度可达ng水平。常用于标记的酶有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)、碱性磷酶(alkaline phosphatase)等。它们与抗体结合不影响抗体活性。这些酶具有一定的稳定性,制成酶标抗体可保存较长时间。目前常用的方法有酶标免疫组化法和酶联免疫吸附法。前者测定细胞表面抗原或组织内的抗原;后者主要测定可溶性抗原或抗体。本法既没有放射性污染又不需昂贵的测试仪器,所以较放射免疫分析法更易推广。

(1)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA):是与上述固相RIA相似的原理,将抗原或抗体吸附在固相载体表面,使抗原抗体反应在固相载体表面进行。可用间接法、双抗体夹心法或竞争法测定抗原或抗体。

(2)夹心法(sandwich assay):将已知的特异抗体包装在固相载体(塑料板凹孔或纸片上),加入待检标本,标本中的抗原即可与载体上的抗原结合,洗去未结合的材料后加入该抗原的酶标记抗体,洗去未结合的酶标抗体,加底物显色,用酶免疫检测仪测量颜色的光密度,可定量测定抗原。间接法(indirect ELISA)常用于检查特异抗体。先将已知特异抗原包被固相载体,加入待检标本(可能含有相应抗体),再加入酶标抗Ig的抗体(即第2抗体),经加底物显色后,根据颜色的光密度计算出标本中抗体的含量。

(3)BAS-ELISA:近年来,对酶免疫分析法的改进是使用生物素-亲和素-过氧化物酶复合物作为指示剂,组成一新的生物放大系统进一步提高检测的敏感度。可用来检测多种抗原抗体系统,如细菌、病毒、肿瘤细胞表面抗原等。1个亲和素(avidin)分子可以结合4个生物素分子(biotin)。结合非常稳定。亲和素和生物素都可与抗体、酶、荧光素等分子结合,而不影响后者的生物活性。1个抗体分子可偶联90个生物素分子,通过生物素又可连接多个亲和素。因此,大大提高检测的敏感度。目前应用的生物-酶标亲和素系统(biotinavidin system-ELISA, BAS-ELISA),是通过生物素标记抗体连接免疫反应系统,同时借助生物素化酶或酶标亲和素引入酶与底物反应系统。各种免疫学测定方法敏感性比较,见表2-2。

表2-2 免疫学测定方法敏感性比较