核酸检测是分子检测吗

第一节　基因诊断的常用技术

基因诊断的基本原理是检测DNA或RNA的结构变化与否，量的多少及表达功能是否正常，以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作为疾病确诊的依据。因此，用于基因诊断的技术包括了DNA和RNA的检测和分析方法，有核酸分子杂交、PCR、单链构象多态性（SSCP）检测、限制酶酶谱分析、DNA芯片技术、DNA测序和DNA多态性连锁分析等。其中，以检测样本中是否存在与探针序列互补的同源核酸序列的核酸分子杂交，能特异地扩增出目的DNA片段的PCR和DNA测序为这些方法的核心技术，而且这几种技术常常是联合使用的。

一、核酸杂交技术

核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法，但随着分子生物学的发展，核酸杂交方法和应用也不断发展。核酸杂交原理是核酸变性和复性理论，即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开成为单链，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。用于基因诊断核酸杂交方法包括Southern印迹杂交（检测DNA样品）、Northern印迹杂交（检测RNA样品）、原位杂交、斑点杂交、液相杂交和DNA芯片技术等。

1.核酸杂交技术简介

（1）制备样品：首先需要从待检测组织样品提取DNA或RNA，或进行组织切片。DNA应先用限制性内切酶消化以产生特定长度的片段，然后通过凝胶电泳将酶切产物按分子大小进行分离。一般来说DNA分子有其独特的限制性内切酶图谱，所以经酶切消化和电泳分离后可在凝胶上形成特定的区带。再将含有DNA片段的凝胶进行变性处理后，直接转印到支持膜上并使其牢固结合，这样待检片段在凝胶上的位置就直接转印在膜上。RNA样品则可直接在变性条件下电泳分离，然后转印并交联固定。

（2）制备探针：核酸探针是指一段能和待检测核酸分子依碱基配对原则而结合的已知核酸片段。它可以是一段序列已知的DNA、RNA或合成的寡核苷酸。在核酸杂交实验中，探针需要被标记上可检测的元素或分子。这样，通过检测与印迹膜上的核酸分子结合的探针分子，既可知道被检测的核酸片段在膜上的位置，也就知道了它的分子大小。

（3）杂交：首先要进行预杂交，即用非特异的核酸溶液封闭膜上的非特异性结合位点。由于转印在膜上的核酸分子已经是变性的分子，所以杂交过程中只需变性标记好的探针，再让探针与膜在特定的温度下反应，然后洗去未结合的探针分子即可。

（4）检测：方法依标记探针的方法而异。用放射性核素标记的探针需要用放射自显影来检测其在膜上的位置；而如果是用地高辛等非放射性方法标记的探针则需要用相应的免疫学方法进行检测。

2.应用核酸杂交技术的常用基因诊断方法

（1）限制性内切酶分析法：此方法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。当待测DNA序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段的状态在电泳迁移率上也会随之改变，借此可做出分析诊断。

（2）DNA限制性片断长度多态性分析：在人类基因组中，平均约每200对碱基可发生一对变异（称为中性突变），中性突变导致个体间核苷酸序列的差异，称为DNA多态性。不少DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶解该DNA片段就会产生长度不同的片断，称为限制性片段长度多态性（RFLP）。RFLR按孟德尔方式遗传，在某一特定家族中，如果某一致病基因与特异的多态性片断紧密连锁，就可用这一多态性片段为一种“遗传标志”，来判断家庭成员或胎儿是否为致病基因的携带者。甲型血友病、囊性纤维病变和苯丙酮尿症等均可借助这一方法得到诊断。

（3）等位基因特异寡核苷酸探针杂交法：遗传疾病的遗传基础是基因序列中发生一种或多种突变。根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成两种寡核苷酸探针：①相应于突变基因碱基序列的寡核苷酸；②相应于正常基因碱基序列的寡核苷酸，用它们分别与受检者DNA进行分子杂交，从而检测受检者基因是否发生突变以及是否有新的突变类型。

3.基因芯片技术　基因芯片又称为DNA微矩阵（DNA microarray），是包被在固相载体上的高密度DNA的微阵列。DNA芯片技术的原理是将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段有规律地排列固定于支持物（如膜、硅片或玻璃片）上，然后通过类似核酸杂交的方法与待测的标记样品按碱基配对原则进行杂交，再通过检测系统对其进行扫描，并用相应软件对信号进行比较和检测，得到所需的生物信息。其特点是可进行基因的高通量、大规模、平行化、集约化的信息处理和功能研究。

基因芯片技术可应用于疾病诊断、新药筛选和毒理学研究、突变/多态性检测、基因表达分析和发现新基因。采用表达谱基因芯片研究基因表达，可以对特定基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断，迅速将某个或几个基因与疾病联系起来，极大地加快这些基因功能的确立，同时进一步研究基因与基因间相互作用的关系。

二、聚合酶链反应技术

核酸杂交反应是一对一的反应，即膜上有一个被检测分子时，相应就有一个标记的探针分子与它杂交。所以整个实验敏感性主要取决于标记探针的质量和杂交后的检测方法。在优化的条件下，核酸杂交可检测到皮克（pg）水平的靶分子，约相当于10⁶个分子。但是，在许多临床情况下无法得到这样的数量。这时可以用PCR来扩增靶分子以特异性地增加靶分子数量，达到提高敏感性的目的。

PCR是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它的基本原理是在同一试管内利用DNA聚合酶催化的反应反复进行同一DNA片段的合成。首先，双链DNA模板在高温下（94～95℃）变性解成单链，然后降低温度使反应体系中大量的特异引物与模板DNA退火，在DNA聚合酶的作用下合成新的双链DNA片段，就此完成了第一轮反应，这3个反应步骤：变性、退火、延伸反复进行，同一段目标DNA就得到大量扩增。聚合酶反应的模板是待检测核酸分子：DNA可直接用于反应，而RNA则需要用反转录酶反转录成为cDNA，然后用作聚合酶反应的模板，称为RT－PCR。反应的引物有两条，分别位于待扩增DNA片段的两端，可启动相对方向的DNA合成。这样从一个模板分子起始的话，经过n次PCR后就可以合成2ⁿ个模板分子。假如进行了30轮反应，则可从一个待检分子合成出2³⁰，即约10⁹个待检分子。对于一段500bp的DNA片段来说，这大约等于1ng的DNA。所以，从很少量的样品即有可能扩增出电泳后肉眼可见的产物。

PCR引物是针对特定基因进行设计的，其与模板的结合是遵循碱基配对原则的，适当的退火温度可以保证引物与模板DNA特异和正确的结合，此外Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性使PCR反应具有特异性强的特点。PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg＝10^－12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg）水平，能从100万个细胞中检出一个靶细胞，因此PCR又具有灵敏度高的特点。PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性－退火－延伸反应，一般在2～4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用放射性核素，无放射性污染、易推广和简便、快速。进行PCR检测不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗漱液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测，对标本的纯度要求低。总之，PCR具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好及易自动化等突出优点。能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至10万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血，甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。因此，PCR是十分重要的基因诊断技术。

PCR扩增产物除了采用凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析外，还采用限制性内切酶酶切、核酸杂交和核酸序列测定等方法进行进一步分析。

三、核酸序列分析

分离出患者的有关基因，测定出碱基排列顺序，找出其变异所在，这是最为确切的基因诊断方法。对于真核生物来说，一般通过PCR将特定基因片段扩增出来后进行序列测定，可见这些基因诊断技术的密切联系。

DNA测序的方法有很多种。目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert（1977）提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都是同样生成互相独立的若干组带有放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。由于DNA上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等，所以每一组产物都是一些寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA全片段上的位置所决定。然后通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将长度仅差一个核苷酸的不同DNA分子分离，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道上，即可从凝胶的放射自影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。

20世纪80年代中期，采用了荧光代替放射性核素，同时因计算机图像识别的进步，出现了自动测序仪（应用双脱氧终止法测序原理）（图14－1）。20世纪90年代中期，测序仪重大改进，集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳，使测序速度大大提高，双脱氧终止法因此成为最常见的测序方法。双脱氧终止法测序原理是利用DNA聚合酶的酶促特点，以单链为模板合成DNA的互补链，利用2′，3′双脱氧核苷三磷酸作底物，使之连接在DNA链的3′末段，终止链的延长。

在测序用的缓冲液中含有4种dNTP及大肠埃希菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段或其测序酶。测序时分成4个反应，每个反应除上述成分外分别加入32 P－标记的双脱氧的核苷三磷酸，然后进行聚合反应。在第1个反应物中，ddATP会随机地代替dATP参加反应，一旦ddATP加入了新合成的DNA链，由于其3位的羟基变成了氢，所以不能继续延伸。因此，第1个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了；同理第2个反应产生的都以C结尾的，第3个反应的都以G结尾，第4个反应的都以T结尾，电泳后就可以读出序列了。若采用4种不同发光颜色的荧光标记的2，3－双脱氧的核苷三磷酸（ddATP，ddCTP，ddGTP，ddTTP），就可以在同一个反应中同时进行，同一泳道上电泳，测量不同波长荧光，经计算机处理转换成DNA序列。

图14－1　双脱氧终止法测序原理

四、单链构象多态性检测

单链构象多态性（signle strand conformation polymorphism，SSCP）是指单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异，这种差异将造成长度相同或相近的单链DNA电泳迁移率不同，从而可用于DNA中单个碱基的置换或数个碱基插入或缺失的检测。用SSCP法检查基因突变时，通常在有突变的DNA片段附近设计一对引物进行PCR扩增，然后将扩增物用甲酰胺等进行变性成为单链，并在非变性PAGE中电泳，突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而可据之做出诊断，故又称为PCR－SSCP。在不含变性剂的中性PAGE中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，比如含单碱基置换，或数个碱基插入或缺失等改变时，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同，从而可将变异DNA与正常DNA区分开。

SSCP是根据电泳条带位置来进行判断，它的检测灵敏度与核酸片段的大小成反比关系。对于＜200bp的片段，SSCP可发现其中70%的突变；而＞500bp的片段，则仅能检出10%～30%的突变。因此，对于＞400bp的PCR产物可以用限制性内切酶处理后进行电泳分析。反应体系中的游离引物可能与PCR产物结合而改变其泳动率，可通过纯化PCR产物和稀释来减少影响，同时为了提高SSCP的敏感性，可采用加入低浓度的变性剂如甘油、尿素、二甲基亚砜或蔗糖等，对同一序列的扩增产物使用2～3种不同条件进行SSCP，可提高检出率。此外，为了避免假阴性结果的出现，常要设置阳性对照。

PCR－SSCP法具有能快速、灵敏地检测有无点突变或多态性的优点，但如欲阐明突变的碱基性质，则需作序列分析。PCR－SSCP技术已被广泛用于癌基因和抑癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因制图等领域。