(一)缺口平移法
这是一种快速、简便和比活性均一的标记方法。当双链DNA分子被随机切开若干个缺口，缺口处形成3′-OH末端，在DNA聚合酶Ⅰ的作用下，就可将核苷酸连接到切口的3′-OH末端。同时该酶具有从5′→3′的核酸外切酶活性，将缺口5′端核苷酸逐个切除，同时又在切口的3′端补上核苷酸，从而使缺口沿5′→3′方向移动，故称为缺口平移。用放射性核苷酸取代原DNA链中不带同位素的同种核苷酸，使得放射性同位素掺入到合成新链中(图5-2)。最合适的切口平移片段一般为50～500个核苷酸。切口平移反应受下列几种因素的影响：①产物的比活性取决于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度；②DNA酶Ⅰ的浓度要适当，过多过少都会影响产物片段的大小；③DNA模板的质量；④反应温度和时间。本法适用于各种结构的双链核酸探针标记，而不适用于单链DNA和RNA的标记。
(二)T4噬菌体多核苷酸激酶标记法
T4多核苷酸激酶可催化ATP分子上的γ-磷酸基团转移到DNA或RNA分子的5′-OH上。T4噬菌体多核苷酸激酶标记法的基本原理是首先用碱性磷酸酶切除DNA双链分子或RNA单链5′末端的磷酸基团，使其产生游离5′-OH，然后在T4多核苷酸激酶催化下将γ-32P-ATP中的γ-32P转移到DNA或RNA片段5′-OH末端，使DNA磷酸化并借此获得标记(图5-3)。本法适用于寡核苷酸探针的标记。
图5-2 缺口平移标记核酸探针
图5-3 T4噬菌体多核苷酸激酶标记法
(三)随机引物法
随机引物法是一种较为理想的核酸探针标记方法。标记原理：将寡核苷酸片段与已变性的单链DNA或RNA退火，使该片段互补结合在单链分子上，然后在反应体系中加入已标记dNTP及Klenow酶，以寡核苷酸为引物，按照碱基互补原则沿5′→3′方向合成一条与模板DNA完全互补的新的DNA链。经变性后，新合成探针片段与模板解离，可得到无数各种大小已标记的探针DNA(图5-4)。由于所用寡核苷酸片段较短，在低温时可与模板DNA随机发生退火反应，故称随机引物法。
图5-4 随机引物标记探针法
(四)聚合酶链反应
聚合酶链反应(PCR)是一种分子生物学新技术，它有着重要的用途，其中之一是用来标记高比活性的DNA探针。在DNA聚合酶的催化下，经过变性、退火和延伸多次循环，可将已标记的核苷酸掺入到扩增的DNA片段中(图5-5)。此法标记率高、简便快速、可大量制备。因此，PCR标记技术特别适用于大规模检测和非放射性标记。该法的缺点是要合成一对特异性PCR引物。
图5-5 聚合酶链反应标记探针法
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