荧光标记是探针标记吗

基因芯片技术主要包括4个步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测以及结果分析。

(一)芯片制备

1.合成探针　这是基因芯片制备的首要步骤。基因芯片的探针包括基因组探针、cDNA探针以及寡核苷酸探针等。对于基因组探针，可先从基因组文库中选择与待测靶序列完全匹配或带有突变位点的序列，然后通过PCR技术扩增获得；cDNA探针可以根据待分析基因表达的mRNA，从cDNA文库中通过PCR技术扩增获取，扩增片段的选择尽可能靠近cDNA序列的3′端，长度一般在1kb左右；较短的寡核苷酸探针，可以直接应用DNA合成仪器合成。

2.探针的固定　目前已有多种方法可以将寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上，基本上可分为两类：一类是原位合成，即在支持物表面原位合成寡核苷酸探针，适用于寡核苷酸，可采用原位光刻合成、压电打印和分子原位合成3种途径；一类是合成点样，即将预先合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器直接点在芯片上，多用于大片段DNA，有时也用于寡核苷酸，甚至mRNA。可以作为基因芯片的固相载体材料主要有固体片状材料和薄膜状材料，固体片状材料包括玻片、硅片等；膜性材料包括聚丙烯膜、硝酸纤维素膜及尼龙膜等。基因芯片多采用载玻片或尼龙膜做载体。

(二)样品制备

待测样品主要是从血细胞或组织中获得的DNA或mRNA。由于测定时需要较多的样品分子，一般先将样品进行扩增，然后进行标记，以提高检测的灵敏度。用于标记待测样品的物质很多，如荧光分子、放射性核素等。样品的标记就是将带有标记的dNTP(Cy3或Cy5-dNTP、生物素-dNTP、32p-dNTP)通过DNA或cDNA的扩增掺入靶分子序列，或者是在合成引物时掺入标记的dNTP，这样扩增靶序列后，扩增产物末端即带有标记物。其中采用较多的是荧光标记法，它是利用标记分子在特定的波长范围可被激光光源激发出荧光这一特点，从而对含有标记分子的样品进行检测。此法没有放射性核素标记的限制，而且具有极高的灵敏性，能够进行定量检测，因此被广泛应用于基因芯片的检测。

(三)杂交反应

杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应，产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，从而减少生物分子之间的错配率。杂交完成之后将矩阵插入扫描仪中进行扫描检测，当结合在目标上的荧光信号被激发时，就可收集到杂交信号数据。在矩阵上每个探针的序列和位置是已知的，因此应用探针矩阵，就可以确定目标核苷酸的特性。

(四)信号检测和分析

杂交反应后，芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件进行图像分析，将荧光转换成数据，即可以获得相关生物信息。杂交信号的检测方法很多，如荧光显影法、质谱法、化学发光和光导纤维等，其中荧光显影法是目前使用最广泛的。

基因芯片技术主要过程如图7-4所示。