核酸探针的非放射性标记技术

(一)光敏生物素标记核酸

光敏生物素是由对光敏感基团和生物素结合而成的一类标记物。它们共同的结构特点是有一个碳原子数目不等的连接臂，一端连接光敏基因，另一端连接是生物素。在光照下，通过光敏基团与碱基之间发生的共价交联反应，使得一端的生物素标记到核酸探针上。光敏生物素标记核酸的方法简便，不需要价格昂贵的酶，只需光照，灵敏度高，可适用于DNA、RNA标记，且这类标记物大多已商品化。

(二)酶促生物素标记核酸

以生物素化的脱氧核苷三磷酸代替相应的32P标记的脱氧核苷三磷酸，在DNA聚合酶催化下，通过缺口平移法或随机引物等方法将它们掺入到DNA分子中，从而获得带有生物素的DNA或RNA探针。

(三)酶标DNA

标记的试剂为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。这些试剂在戊二醛的作用下与变性后的DNA结合，生成酶标DNA分子。

(四)荧光素标记核酸探针

核酸探针的荧光标记分为直接法和间接法，前者是通过荧光素直接与探针核苷或磷酸戊糖骨架共价连结，或掺入荧光素-核苷三磷酸以标记探针。后者是先将生物素或地高辛等半抗原修饰到探针上，然后再用偶联有荧光素的相应半抗原抗体，通过抗原-抗体之间的特异性作用将荧光基团标记到探针上。

(五)地高辛标记核酸探针

地高辛是一种具有半抗原性质的化合物。先将地高辛配基标记于脱氧尿嘧啶三磷酸核苷(dUTP)上形成dig-11-dUTP。然后再通过随机引物或缺口平移法，在DNA聚合酶的催化下将dig-11-dUTP掺入到核酸分子中，构成dig-配基标记的核酸探针。

与放射性标记相比，地高辛标记探针具有非放射性探针的优点，不受半衰期限制，探针可长期保存。与生物素标记探针相比，地高辛探针不受组织、细胞中内源性生物素的干扰，敏感性高，检测产物颜色鲜艳，反差好，背景染色低等优点，故应用广泛。