免疫学技术

免疫学技术目前在生物学和医学领域应用较广，在医学昆虫学的研究主要有以下几个方面：

（一）吸血昆虫血源鉴定

吸血昆虫（hematophagus），如蚊等的血源鉴定是虫媒病流行病学调查的重要内容，也是判断媒介作用的一个重要指征。鉴定方法主要采用免疫学方法，以下简单介绍方法：

1．免疫沉淀法　主要采用小试管法、对流免疫电泳法、双向琼脂扩散法、醋酸纤维膜微量免疫扩散法等常规免疫学方法，以昆虫胃血清和抗血清的反应判断结果。王玉玉等（1993）采用环状沉淀法对云南8个地州市20个县的中华按蚊、微小按蚊、嗜血按蚊和多斑按蚊进行了胃血血源的鉴定。

2．被动血凝抑制试验　以附着有特异性蛋白抗原的绵羊红细胞作为指示系统，若胃血与抗体相结合，则红细胞不凝集，呈现阳性反应，该法敏感性和特异性较高，可用于近缘种的血源鉴别。

3．免疫荧光试验法　用纯化的红细胞膜免疫家兔，第二抗体以异氰荧光素或异硫氰四甲玫瑰红标记。待鉴定的胃血制成玻片标本，再以丙酮固定，按常规间接荧光抗体技术染色。该法能鉴别吸血后44h的胃血。

4．酶联免疫吸附试验法　以辣根过氧化物酶标记，复合物既有免疫活性又具有酶的功能，试验结果以分光光度计或酶标仪测量酶促反应产物的量来确定。

5．PAP试验斑点法　以具有高度亲和力的硝酸纤维膜为固相载体，用过氧化物酶抗过氧化物酶为指示系统。先用胃血抗原包被载体膜，与一抗孵育后，再与二抗反应，然后加入酶抗酶抗体复合物，其中抗酶抗体从制备一抗的同种动物得到。结果判定根据酶反应产物在膜上的显色程度。其敏感性较酶联免疫吸附试验高，能正确判别吸人血28h后的蚊胃血。

6．血红蛋白结晶法　以待鉴定蚊胃血的血红蛋白结晶与实验室制备的人及动物血红蛋白结晶进行形态比较而判别血源。且可因蚊种不同，胃血消化过程有差异，对血红蛋白结晶的影响亦有不同。该法对鉴定豚鼠、山羊和马的效果较佳，而对人、牛和猪血则难以鉴定。

在几种血源鉴定方法中，被动血凝抑制实验和免疫荧光法虽然敏感性高，然而操作要求严格、需复杂器材；酶联免疫吸附试验具有较高的敏感性和特异性，结果测定可通过仪器自动进行定量分析；PAP试验斑点法以纸膜为载体，方法简便，不需复杂仪器，适合现场调查应用，是目前较为满意的血源鉴定方法。

（二）单克隆抗体的应用

单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）具有专一性和敏感性，能快速检测毫微克量的单一抗原。

1．昆虫分类研究中的应用　小型昆虫尤其是幼虫和虫卵难以在形态上进行分类，由于McAb的高度特异性，因此可作为昆虫分类、鉴定的理想工具。

将某种昆虫蛋白分子作为McAb，检测该抗体与其他种的蛋白的反应情况，做定量分析，从而确定各个种之间的血清学距离，用于不同种动物器官的同源性比较。另外还可快速鉴定昆虫的虫卵应用于杀虫剂的研究和进行检疫性昆虫的诊断分析等等。

Tungtrongchitr A等（2004）采用单克隆抗体和多克隆抗体夹心ELISA法检测特异的单克隆抗体，用以检查泰国地区与蜚蠊的分类及变态反应性疾病相关的变应原浓度。结果显示泰国地区美洲大蠊（P．americana）是导致变态反应性疾病尤其是哮喘的主要蜚蠊。

2．在昆虫发育生物学中的应用　在昆虫的发育过程中，其细胞表面物质起重要作用。因此可应用McAb结合免疫示踪技术作为监测昆虫器官分化、分布和组织形成的理想探针，即利用针对这些物质的McAb可定位它们的特定部位及其在发育过程中的变化分析成虫芽器官发育的分子基础和遗传性的变化。

例如将果蝇胚胎细胞和成虫芽器官细胞表面抗原的McAb与免疫荧光测定、放射免疫测定相结合，可检测胚胎细胞和成虫芽器官细胞表面抗原的空间和时间分布；利用抗该果蝇成虫芽器官胞外基质特异性抗原的McAb确定此抗原物质的分布及与翅芽分化关系；利用针对该果蝇翅芽表面蛋白抗原的McAb作为发育标记物，研究翅芽遗传性变化等。McAb还可用于检测神经抗原的变化，示踪神经发育过程，如以相应的McAb为探针结合免疫荧光测定，检测果蝇胚胎神经发育过程中潜在识别物质，变态过程中神经抗原的变化等。

3．在昆虫生理学中的应用　在昆虫生殖生理研究中，McAb可用于检测卵黄蛋白的滴度；确定卵巢抗原的分布及在卵子发生过程中的变化，确定生殖附腺分泌物的分布、滴度和分泌途径。例如：将酶联免疫吸附测定法（ELISA）和相应的卵黄蛋白McAb相结合检测伊蚊卵黄蛋白在血淋巴中的滴度及被卵巢吸收的动态；研究20－羟基蜕皮酮对埃及伊蚊卵黄蛋白合成与吸收的调控等；将抗果蝇卵巢的McAb与免疫荧光测定相结合进行卵巢抗原定位，并了解其在卵子发生过程中的变化。

4．在昆虫生物化学中的应用　McAb可用于昆虫细胞内某些酶的定位、提纯及结构和功能的研究。如在果蝇RNA聚合酶Ⅱ的研究中，将果蝇RNA聚合酶Ⅱ单克隆抗体与免疫荧光测定相结合，确定该酶分布于多线染色体的膨突和间带；将微量果蝇RNA聚合酶Ⅱ单克隆抗体注射于两栖纲动物的活卵母细胞内，经光镜电镜和生化研究发现：该抗体能阻止染色体环中DNA转录的发生，但不影响RNA聚合酶Ⅰ、Ⅲ的活性，确定了此酶的功能。

5．昆虫的防制　AgMucl是一种冈比亚按蚊的中肠蛋白，当蚊虫吸血时产生且含量丰富。AgMucl cDNA免疫小鼠获得的血浆膜饲蚊虫与对照组比较有非常高的死亡率。由于疟原虫动合子结合中肠上皮细胞糖的残基侵入中肠，AgMucl可能是传播阻断疫苗的靶抗原；另一个具有两种作用的靶抗原抗体是来自于冈比亚按蚊中肠的单克隆抗体，此抗体既可阻断寄生虫的传播又可杀死媒介蚊虫。

（三）抗吸血昆虫疫苗的研究

媒介昆虫叮咬人时，免疫因子随血液进人体内，引起昆虫的死亡或生理能力减弱。抗体、凝集素、补体、免疫效应细胞（细胞毒性T－细胞、NK细胞、吞噬细胞）等组成了免疫因子，它们可单独影响或协同影响昆虫。吸血昆虫叮咬人时，进入血流的涎腺分泌物可诱导人的体液和细胞免疫反应。吸血时不进入血流的昆虫抗原可诱导宿主的免疫反应，且免疫反应的活性成分可随血液进入昆虫胃内，并通过胃壁进入血腔，干扰昆虫的正常生理过程，导致昆虫生殖力下降和死亡。因诱导这—免疫的成分集中在昆虫的中肠、卵巢、飞行肌、涎腺等组织，所以这些组织已成为抗吸血昆虫疫苗研究的靶抗原。

随着昆虫现代分子生物学技术应用的发展，逐渐把目光转向抗媒介的分子靶。基因分析和数据库研究能够在众多昆虫中迅速识别出现有的抗媒介抗原的同质物。目前大多应用Reductionist方法，体内或体外系统下选择、实验抗原或免疫因子，再用多种靶抗原免疫众多动物以寻找理想的抗媒介抗原或者分离中肠腔的微绒毛，或用SDSPAGE分离纯化中肠蛋白，用不同相对分子质量的蛋白质免疫动物以代替中肠组织的匀浆。另一种Reductionist方法是运用表达文库免疫技术，即用来自血餐蚊虫中肠的cDNA表达文库免疫动物，然后观察其对蚊虫的影响。也可采用免疫效应因子选择抗原、免疫动物，再评价蚊虫生存率和生殖率。

另外，应用噬菌体展示抗体和多肽的方法亦能在体外系统下进行选择。