寄生虫病的免疫学检验技术

第八节　寄生虫病的免疫学检验技术

寄生虫作为一种病原体，在其寄生过程中，从生长、发育、繁殖到死亡，必然有分泌、有排泄、有死后虫体的崩解，这些代谢物和虫体崩解的产物在宿主体内都起着抗原的作用，而促使宿主产生相应的抗体，因此可利用抗原抗体间产生的反应（或是用已知抗原去测定机体内抗体的存在，或是用已知的抗体去测定机体内抗原的存在）以诊断寄生虫病。但由于寄生虫体结构的复杂，寄生虫在不同的生活阶段所产生的不同种的蛋白质均起抗原作用，而抗体形成的时间、抗原抗体的作用方式及抗原抗体结合的最适合时间和条件尚未完全弄清楚，所以寄生虫病的免疫过程变得十分复杂。因此以免疫反应作为寄生虫病的诊断手段，就不如以发现病原体（或其某一阶段）来诊断寄生虫病那样可靠。但是当在动物生前无法证实病原体（如体内幼虫的寄生）或寻找病原比较困难的情况下，免疫反应仍然被视为诊断寄生虫病的有效办法。

随着科学的发展，微生物学中所采用的免疫学的诊断方法，均或多或少地被引用到寄生虫病的诊断工作中来，生物化学的发展更给抗原的提纯技术创造了有利条件。而且还有一些是寄生虫病的诊断中所特有的反应。

一、变态反应

变态反应是寄生虫病诊断中常用的手段之一，其中的皮内反应更是最常用的反应。目前此法的主要问题是抗原（即反应原）的制备和提纯。

（一）抗原的提取

在棘球蚴的诊断中，其抗原可直接采用棘球蚴的囊液；在其他寄生虫病，抗原常需经过加工提纯。对某一特种寄生虫病，根据抗原制备的原料不同、抗原性质的不同，各有一定的制备方法。

1.浸出抗原　将病原体洗净，真空干燥或低温干燥，研磨成粉，加生理盐水作100倍稀释，加入防腐剂（0.3%～0.5%的酚）。浸液应不断搅动，可冷浸或热浸，浸制时间随温度而不同，冷浸（在冰箱内）需3～7d，热浸（56℃）需2～6h，而后在离心机中离心沉淀，吸取上层清液，用间歇法灭菌。滤出液即可作为抗原。

2.三氯醋酸提纯抗原　适用于棘球蚴抗原的提纯。取棘球蚴囊液，加入5%的三氯醋酸使其蛋白沉淀，以离心法收集沉淀；再用蒸馏水反复冲洗沉淀，最后将沉淀物混悬于蒸馏水中，慢慢滴加10% NaOH溶液，直到其中沉淀全部溶解为止。溶液在低温下加0.1N冰醋酸重新使蛋白质沉淀，再以离心法收集沉淀，以蒸馏水洗去酸，在37℃温箱中或氯化钙干燥器中干燥，所得干粉，即供配制抗原用。

3.酸溶性蛋白质抗原　将蠕虫的成虫或幼虫研制成干粉，用滤纸包起，置Soxhlet回流器中以石油醚脱脂，经4～5d后，得脱脂的虫体干粉。将干粉浸于pH8.0～8.3的硼酸缓冲液中，搅拌5～10min，置于4℃冰箱中6h，以离心法除去沉淀，再加入pH4.6的溶液于上清液，再离心沉淀，其上清液即酸溶性蛋白抗原。

4.多糖抗原　将虫干粉浸于pH8.0～8.3的硼酸缓冲液中，置沸水浴上半小时，边煮边搅，而后取下冷却，置4℃冰箱中4h取出，离心除去沉淀；取上清液加4倍量的95%酒精，再加适量氯化钠使成为0.5%的盐水溶液，再放入4℃冰箱中4h，取出，离心沉淀，所得白色沉淀加入pH8.0～8.3的硼酸缓冲液使溶解，再离心沉淀，除去不溶物，再在上清液中加入95%酒精以沉淀其多糖体，离心，取得白色沉淀，真空干燥后即得多糖抗原。

（二）可用皮内反应作诊断的寄生虫病

有一些寄生虫病可用皮内反应作为诊断方法，但目前被广泛应用的为数不多，曾试用的疾病有弓浆虫病、锥虫病、片形吸虫病、棘球蚴病、多头蚴病、猪囊虫病、冠尾线虫病、马脑脊髓丝虫病、蛔虫病、牛皮蝇蚴病等。现介绍两种常用的皮内变态反应。

1.弓浆虫病的皮内反应　先取人工感染弓浆虫的小白鼠，收集其含有弓浆虫的腹水，用离心法将虫体浓集，加蒸馏水，以反复冻融或超声波将虫体崩解破坏，而后冻干制成皮内反应抗原。有人建议再将抗原用丙酮醚抽提以提纯。

将稀释的抗原0.2ml注射于猪的耳根部皮内，以观察其皮肤反应。反应在48h后出现，当红肿面直径超过15mm时为阳性，10～15mm为可疑，9mm以下为阴性。

弓浆虫的皮内反应阳性，只在猪患本病的晚期才呈现，因此本法只适用于流行病学的调查，以检出慢性的隐性的弓浆虫病。

2.棘球蚴病的皮内反应　这是1911年由Casoni氏首创，最早用皮内反应诊断寄生虫病的方法，因此又称Casoni氏反应。最初以无菌手术抽取棘球蚴囊液作为反应原。囊液在使用前最好进行一次无菌试验；如囊液混浊，应先离心沉淀或过滤，以达到完全透明。此囊液可加入0.5%氯仿防腐，以利于保存，保存期达6个月。Dennis提出三氯醋酸提纯法。Orihara（1967年）认为：将皮内反应抗原经100℃15min处理，可破坏抗原中的宿主成分，因虫体抗原对热是稳定的，这样可增加抗原的特异性和灵敏性。

操作时是将抗原0.1～0.2ml，以皮内注射针头注射于无毛处（或先剃毛）的皮内。阳性反应时，在注射后5～l0min内（最迟不超过0.5～1h）注射部出现红肿，红肿面积直径可达5～20mm。以后红肿部周围发生红色圆晕而后变紫红色。

二、沉淀反应

感染寄生虫后，动物血清中即含有特异性抗体，此抗体与病原体的抗原相结合，可产生沉淀。用此法测定动物体内抗体的存在与否，以决定动物是否感染有某种寄生虫。

（一）活体沉淀反应

一般取寄生虫生活的各幼虫阶段或虫卵，放于被检者的血清内，如在幼虫或虫卵周围或某一部位形成沉淀，则表示被检者血清内已含有抗体，即说明被检者已受该寄生虫的感染。根据这一原理所研制的方法有：血吸虫病的环卵反应、尾蚴膜反应和蛔虫幼虫的沉淀反应等，虽在兽医临床上尚未实际应用，但已取得了很多的经验。

1.分体吸虫病的环卵试验：其方法是取人工感染日本分体吸虫的兔肝，捣碎后，经分层过滤、离心沉淀或以胰酶消化肝组织，而后将所得虫卵悬液加福尔马林醛化，减压低温干燥制成干卵备用。

试验时，在载玻片上滴加被检牛血清1滴，挑取干卵1小团（约100个虫卵）混于血清中，覆以盖玻片，四周用石蜡封固，放入37℃温箱中，24h后取出检查。阳性者，则于虫卵四周出现泡状、索状、耳状、网状等血清学反应的沉淀物质。判定时，根据反应卵的百分比、反应物的面积和形状为指征。

2.蛔虫幼虫沉淀反应　为了对蛔虫幼虫移行期所致的蛔虫性肺炎进行诊断，可使用幼虫沉淀反应。其方法是：用人工感染蛔虫的小白鼠，6d后自肺内分离幼虫；经生理盐水洗净后，放入数滴被检血清中，置37%温箱中24h后，如在蛔虫幼虫的口部和肛门等处出现沉淀，则判断为阳性。

（二）琼脂扩散沉淀反应

在诊断上采用的琼脂扩散沉淀反应有单相单扩散、单相双扩散、双相单扩散和双相双扩散；还有借电流力量促使其沉淀发生的对流免疫电泳法。在此主要介绍马锥虫病诊断上所采用的双相双扩散的沉淀反应，即马媾疫琼脂扩散沉淀反应。

1.沉淀原的制备　自病马采取病料，接种于公兔的睾丸实质中，继代数次；当在兔外周血液出现虫体时，采血接种到犬。在人工感染犬后的第3d，给犬进行摘脾手术，术后检查犬血，当以其外周血作压滴检查，600倍镜下，每个视野虫体量达到150条以上时，即可放血，加2%柠檬酸钠生理盐水以抗凝，离心沉淀；沉淀后吸取上层白色含虫层，混悬于生理盐水中，再沉淀；如此反复多次，得到较纯的虫体沉淀物。将沉淀物放乳钵中研磨4小时，放入振荡瓶中，加小玻璃珠，在振荡器上振荡8h。按1：9比例加生理盐水。最后按其量加入1/000的硫柳汞防腐，保存于冰箱中，即为沉淀原。

2.琼脂凝胶板的制备：在蒸馏水中加入5%琼脂，高压蒸气下使其溶解；冷凝后，切取上层透明部分，切成碎块，在蒸馏水中漂洗2～3d，每天换水2～3次，最后将水拧干，保存于冰箱内。

做琼脂凝胶板时，取以上凝胶块150g，加水500ml，溶解，使其含琼脂1.5%，再加入氯化钠，（含量达0.85%）和硫柳汞，（含量为1/000，高压灭菌后，倒入平皿内，使琼脂厚度约为5mm左右。

琼脂凝固后，在琼脂板上以直径8mm的打孔器打孔。一般在皿的正中打一孔，而后以4mm的距离在中央孔的周围打6个孔，使其成梅花状分布，再用熔化的琼脂，向每孔中滴1～2滴，将孔底封闭。

3.操作方法　将皿上各孔编号；以吸管吸取抗原0.2ml，注于中央孔内；然后向周围四孔加入待检血清0.2ml，留下两孔，一孔加已知阳性血清，一孔加已知阴性血清为对照。如此，每一平皿可检查可疑病畜4头。将琼脂板放入25℃～28℃温箱内，24h后取出检查，阳性者可在血清孔与抗原孔之间的琼脂上出现一条白色沉淀。

三、凝集反应

凝集反应所用抗原有活的虫体抗原（多半用于微小的原生动物）和液状抗原。以液状抗原进行本试验时，多半将其吸附于惰性颗粒上，再进行间接凝集试验。用以吸附抗原作为载体的颗粒有：红细胞、卡红（carmine）、炭粉、皂土（bentonite）和乳胶（1atex）等。

（一）活抗原凝集反应　马、牛伊氏锥虫病的团集反应（agglomeration）即属此反应。操作时，自感染有锥虫的实验动物采血，在血液中见有大量虫体时，将所采血以改良阿氏液稀释（阿氏液是以葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.8g，柠檬酸0.055g，氯化钠0.42g，蒸馏水100ml配成）。以在显微镜下450～600倍放大时，每个视野中含虫体30～50个，并见虫体运动活泼，无自然团集现象为准。此时将被检血清1滴加在载玻片上，将上述活虫1滴加入，混匀，置37℃温箱中，20～30min后取出镜检。虫体在阳性血清中以后端相互靠拢，成菊花状排列，但虫体仍保持活动。

活抗原凝集反应，国外尚介绍用于牛胎毛滴虫病，并报道胎毛滴虫的凝集素除见于血清中外，尚出现于感染母牛的阴道黏液中，故可见虫体在含有阴道黏液的琼脂平板上出现凝集现象，而以此为指标作阴道毛滴虫病的诊断。活抗原凝集反应亦曾用于弓浆虫的诊断。

（二）间接血球凝集反应

本法是以绵羊红细胞为载体，将抗原吸附于红细胞上，再与相应抗体作用，阳性者则出现吸附有抗原的红细胞在抗体的作用下发生凝集。本反应已用于弓浆虫病、棘球蚴病和旋毛虫病的试验诊断。现介绍弓浆虫间接血球凝集反应（简称IHA或HA）。

1.材料准备

（1）抗原制备：由人工感染弓浆虫的小白鼠采集腹水，收集于生理盐水中，以2500r/min离心15min，弃去上清液，在沉淀中加入10倍量蒸馏水，混匀，置4℃中过夜，再以10000r/min离心1h，取上清液，加等量的1.7%盐水，分装于小试管中。－20℃下保存备用。

（2）磷酸缓冲液（PBS）：分pH7.2和pH6.4两种。pH7.2的配方是：0.15mol/L的氯化钠液100ml，0.15mol/L的磷酸二氢钾液23.9ml和0.15mol/L的磷酸二钠溶液76ml混合而成。pH6.4的三液混合比是100∶67.7∶32.2。

（3）正常兔血清（NRS）和正常猪血清（NSS）：即取正常兔血清，加入绵羊红细胞以吸收去其正常凝集素，再以PBS液配成1%～3%的溶液，即NRS；正常猪血清则改用猪血清制备，方法相同。

（4）配制含1%鞣酸的PBS液。

2.致敏绵羊红细胞的制作　采集羊血，抗凝，加pH7.2的PBS，而后以2000r/min离心15min，取下沉的细胞层，再以上清液洗涤，离心，反复进行3次，最后以细胞沉淀加PBS配成2.5%的细胞悬液，再加入含1%鞣酸的PBS，使其中鞣酸量为1/000或0.5/000，37℃水浴中15min，取出，再离心沉淀，并以pH7.2的PBS液离心洗涤3～4次，洗去多余的鞣酸，再加pH7.2的PBS液，使成2.5%的鞣酸红细胞悬液。

以2.5%鞣酸羊红细胞悬液1份，抗原液1份和pH6.4的PBS液4份混合，摇匀，置室温中15min，加1% NRS液，而后离心洗涤2次，在沉压细胞中加入3% NSS液，使成2.5%的红细胞悬液，此即致敏羊红细胞悬液。

3.试验操作：取被检血清0.5ml置凝集试管中，加入2% NRS液或3% NSS液1.5ml，置56℃水浴中30min以灭能；加入未致敏的羊红细胞悬液2ml，放入4℃冰箱中过夜（吸取其对羊红细胞的非特异性凝集素）；离心沉淀，吸取其上清液，即为1∶8的被检血清；将上清液做成1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256等系列稀释液；加入致敏羊红细胞悬液0.05ml（1滴）；置4℃中，2h与24h各检查1次。

4.结果判断将试管取出，观察。

＋＋＋＋∶红细胞均匀地铺于管底。

＋＋＋∶红细胞铺于管底，但边缘不整。

＋＋∶红细胞成环状沉于管底，边缘可见小凝集块。

＋∶红细胞于管底形成一小团，但边缘不光滑，有小凝块。

－∶红细胞于管底形成小圆团，光滑整齐。

1∶64的稀释管出现＋＋者，判断为阳性。

四、补体结合试验（CFT）

在传染病诊断中所采用的补体结合反应也广泛地应用于一些寄生虫病的诊断，由于设备和操作较复杂，故未能大面积地应用，但已被介绍应用于诊断锥虫病、焦虫病、边虫病、弓浆虫病、棘球蚴病和旋毛虫病。在应用时，除抗原的制备与传染病不同外，各项具体操作均与其相同。

（一）锥虫病补体结合试验抗原的制备

1.明胶缓冲液　以硼酸12.5g加到1mol/L NaOH溶液100ml和蒸馏水25ml中，待硼酸溶解后，补加蒸馏水使全量达1000ml，为第1液。另以蒸馏水250ml，加纯盐酸8.4ml，再补加蒸馏水达1000ml，为第2液。以第1液61.2ml和第2液63.8ml混合，加氯化钠3.2g、明胶0.1g和蒸馏水375ml，100℃加热30min使明胶溶化，校正其pH值到7.2～7.4，（此时如pH过高可加第2液，pH值过低可加第1液），用滤纸或脱脂棉过滤，分装小瓶，以121℃高压蒸气灭菌30min，最后pH值为7.3～7.5，保存于冰箱中。

2.抗原制备：取在小白鼠继代的伊氏锥虫接种于犬腹腔中，一般在5～7d后，由犬耳静脉采血检查，当在600倍镜下每视野中的虫体数达100条以上时，即可用无菌手术全身放血，按1份血液加2份2%柠檬酸钠生理盐水抗凝。将此血以纱布过滤，离心分离后，取红细胞层表面的白色虫膜混悬于生理盐水中，再离心、再分离，如此反复洗涤，最后可得洁白的锥虫团块，将其按1∶9比例加入明胶缓冲液后，倒入中性硬质振荡瓶中，在10℃温度下振荡48～72h，再离心分离，则上层液呈乳浊状，其浊度应相当于McFarland比浊管的第1号或第2号。吸取乳浊液，测定其效价，加中性纯甘油等量，分装于中性安瓿中，在低温冰箱中冻结保存，即为抗原，其效价应在120～200倍。保存期不少于30个月。

在进行补体结合试验时，将抗原稀释到两个单位，每管抗原用量是0.5ml。

（二）棘球蚴病补体结合抗原的制备

与皮内反应抗原制法相同。

（三）弓浆虫病补体结合抗原的制备

可将弓浆虫接种于鸡胚或小白鼠后采集虫体，以反复冻融处理，而后以超声波破坏之，取上清液为抗原。旋毛虫则用肌肉中的幼虫，分离后，制成生理盐水浸液或酸溶性部分做抗原。

在某些动物（如家禽和猪），血清中的抗体与相应的抗原相结合后，不但不能固定补体，而且还能抑制另一些动物的已知免疫血清与该相应抗原结合补体的能力，因此，以后再加溶血系统，如出现溶血则为阳性反应，而不溶血则为阴性反应，即所谓补体结合抑制试验。家禽的某些疾病和猪的弓浆虫病诊断多采用补体结合抑制试验。

五、荧光抗体试验

荧光抗体技术在免疫血清诊断上已广泛应用。常用的有直接荧光抗体法和间接荧光抗体法，此外还有荧光抗补体法和可溶性抗原荧光抗体法等。

（一）直接荧光抗体法

本法是以已知抗体与荧光色素相结合。当待检病料中怀疑含有相应病原时，可将病料用此荧光抗体处理。如病料中有该病原，则将与荧光抗体相结合。以此结合后的病料在荧光显微镜下检查，即可见有闪光的病原存在。

本法多用于显示病料中是否含有某种病原体，特别是那些在显微镜下形态上不易肯定的病原体，如用于弓浆虫、边虫、肌肉中变了形的旋毛虫等。

（二）间接荧光抗体法

在此法中，抗体在整个反应中除与抗原结合起抗体的作用外，又将抗体分子本身作为抗原，注射到另一动物体内，形成抗抗体。将抗抗体与荧光色素相结合。以已知的病原做成抹片与未知的可疑患畜血清相作用。如该畜是病畜，有抗体存在，则该抗体即与病原结合，并附着在载玻片上，再用荧光抗抗体处理，玻片上即出现荧光。反之，健畜没有抗体存在，玻片上的已知病原不被抗体结合，则抗抗体也不可能结合在载玻片上。

1.猪弓浆虫病的间接荧光抗体诊断法

（1）抗原制备：取人工感染弓浆虫的小白鼠腹水，反复以生理盐水洗涤，除去虫体以外的杂质，最后取虫体沉淀，加pH7.2的PBS液（配法见间接细胞凝集反应），并加福尔马林，使福尔马林在其中的浓度为1%，置室温中30min固定；再以生理盐水用离心法洗涤，最后将沉淀滴于载玻片上，37℃中1h，待干，保存于－20℃冰箱内，即为抗原涂片，保存期4个月。

（2）抗猪血清荧光抗体（荧光抗抗体）的制备：采猪血清，用硫酸铵沉淀法提取猪的IgG。以所得IgG加弗氏佐剂（Freund’s，adjuvant，其制备方法是以液体石蜡9份，羊毛脂1份，加1%的吐温-80，加热溶解后，高压灭菌。临用时，在每毫升中加入卡介苗1～2mg），混合后给兔高度免疫，得含抗猪血清抗体的兔血清；再将兔血清以柱析法提取其IgG。以1∶20v/w的异硫氰酸荧光黄（F1TC）与IgG结合，结合后透析5d，再以小白鼠肝粉吸附，以除去其中非特异性因素。

（3）操作方法：当欲测定某猪是否已被弓浆虫感染而产生弓浆虫抗体时，采该猪血液，分离血清、并做序列稀释。

将已制备的含有弓浆虫虫体的抗原涂片，滴加稀释的被检血清，在37℃水浴上作用40min，而后将涂片置pH7.2的磷酸盐缓冲液中7min，漂洗2次，取出玻片，再滴加抗猪血清荧光抗体，37℃温箱中20min，再加pH7.2的磷酸盐缓冲液，在其中放7min，漂洗2次，而后加9份甘油和1份磷酸盐缓冲液的混合液1滴，封加盖玻片，在400倍荧光显微镜下检查。

（4）判定标准：荧光显微镜下检查时的判定标准如下。

－：没有发现染有荧光的弓浆虫体。

±：弓浆虫体上现有微弱荧光。

＋：弓浆虫体上现有明亮荧光。

＋＋：全部虫体上发荧光。

2.血吸虫病的间接荧光抗体诊断法　以成虫或尾蚴制作抗原，如以成虫制作抗原，则以新采取的雄成虫，用甲基纤维素包埋后冰冻，切成4～6μm厚度的冰冻切片，充分干燥，以丙酮固定10min。如以尾蚴制作抗原，则在载玻片上先涂一薄层鸡蛋蛋白，充分干燥，再涂上新鲜尾蚴20～30条，干后，以95%酒精室温中固定5min。

取以上任一种抗原玻片，滴加被检血清，置密闭湿盒内37℃作用45min，在磷酸缓冲液中洗3次，每次15min，吹干，再加以FITC标记的兔抗牛血清1滴，再置密闭湿盒内37%作用45min，取出用磷酸盐缓冲液洗3次，吹干；用3%伊文思蓝（Evans blue）对比染色，丙酮脱色，滴加9份甘油与1份磷酸盐缓冲液混合成的包埋剂，加盖玻片荧光显微镜下检查。

六、其他免疫血清试验

用于寄生虫病的免疫血清学反应有多种，如弓浆虫病所特用的染料试验、中和试验、对流免疫电泳、白细胞游走抑制试验、酶标记免疫吸附试验、幼虫活动抑制试验等等。但其中多数只作为一种研究工作的手段，用于诊断疾病的只有弓浆虫病所特用的染料试验（即弓浆虫染料试验），兹介绍如下。

1.抗原制作　采集人工接种弓浆虫的小白鼠72h后的腹水，加生理盐水，反复离心洗涤2～3次，最后以生理盐水混悬，使每毫升混悬液中含弓浆虫约500万个（即取1滴于玻片上，600倍显微镜下每视野有虫体30～40个）。

2.补助因子　取健康人血清（应不含弓浆虫抗体），预检其对着色影响不超过10%。

3.染液　以美蓝在95%酒精中的饱和溶液（约为1.48%）1份，加pH11的缓冲液9份混合。pH11的缓冲液是用0.53%的碳酸钠溶液97.3ml，加1.91%的硼砂（Na₂B₄O₇·10H₂O）溶液2.7ml。

4.操作　取被检动物血清，置56℃水浴中30min灭能。用生理盐水做1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128等稀释，而后各取0.1ml，加补助因子0.2ml，再加抗原0.1ml，置37℃温箱中12h，取出待冷，加美蓝染液2～4滴，振荡5～6min后取出检查。

在以上操作的同时，应另作三种对照。

对照①：生理盐水0.1ml＋补助因子0.2ml＋抗原＋美蓝染液。

对照②：生理盐水0.1 ml＋抗原＋美蓝染液。

对照③：生理盐水0.1ml＋补助因子0.2ml＋已知阳性血清+抗原+美蓝染液。

检查时，在400倍显微镜下观察，其中虫体50%以上不被染色者为阳性指标。对照①应全部着色。对照②应90%以上着色。对照③应全部不着色。

猪的判断指标：当1∶16～1∶32呈阳性时为可疑；1∶64为阳性时判断该猪为已被感染。