真菌感染的免疫学检测技术

血清学检测主要包括抗原检测、抗体检测和代谢物检测等。其中真菌抗原和代谢物成分的检测敏感性高、特异性好，能够反映病情的变化，对于免疫功能受损的患者更有价值，已应用于隐球菌病、曲霉病、念珠菌病及组织胞浆菌病的诊断。

一、真菌抗原的检测

理想真菌抗原应具备的条件：①侵袭性真菌感染早期即显著升高，且病情发展中持续存在；②检测阳性时能提示感染，而不受真菌定植的影响；③真菌抗原高度保守，与人体或其他微生物成分无交叉反应；④抗真菌治疗前抗原应显著升高，治疗有效后能逐渐或显著降低，以帮助检测疗效；⑤所构建的方法稳定、实用、易于推广。真菌抗原目前主要检测烯醇化酶、葡聚糖、甘露糖和不耐热抗原等。

1．烯醇化酶　是糖酵解所必需的细胞内酶，广泛存在于真菌细胞中。检测念珠菌血症患者血中烯醇化酶抗原可使用多克隆抗体采用斑点免疫结合法或双夹心脂质体免疫分析，阳性率在71．8%～75．0%。在健康和免疫缺陷的免疫人群中，以血清中是否含有抗烯醇化酶抗体来诊断深部念珠菌病，其特异性和敏感性可达96．4%和81．5%。动态检测患者血清中抗烯醇化酶抗体和抗体滴度可提高临床应用价值。

2．G试验　本实验可测定（1，3）－β－D－葡聚糖（BG），BG是除接合菌和隐球菌以外的真菌胞壁的主要成分之一，通过激活鲎试验中的G因子引发级联凝固反应，用于诊断IFl。BG不存在于细菌、病毒和人类细胞中，在人体液、血液和组织中能被检测，是一种真菌广谱循环标志物。有多种商业化方法检测BG，可用于念珠菌病及曲霉菌病的早期诊断。Fungitell Assay?（Cap Cod）可在2h内完成检测，也可用于诊断卡氏肺孢子虫肺炎。一般来说，检测BG可用于对系统性真菌病的筛选，其浓度与症状的消长成正比。但BG结果的解释最好结合临床情况，并进行进一步验证。血液透析患者、使用免疫球蛋白和暴露于其他含有葡聚糖成分材料的患者，易出现假阳性，有报道其与阿莫西林－克拉维酸以及革兰阳性菌细胞壁成分发生交叉反应。

3．不耐热抗原　Cand－Tec抗原是指可用念珠菌属检测系统检测的一类念珠菌蛋白抗原。Cand－Tec MT微滴度法是一种早期诊断深部真菌感染和准确评价治疗效果的有效方法。但Cand－Tec的敏感性和特异性各家报道不一，且类风湿因子可产生假阳性，加之其靶抗原的属性和功能不明，限制了其进一步发展。

4．半乳甘露聚糖（GM）抗原检测　GM是第一个用于侵袭性曲霉菌病的抗原（表7－3）。已有应用RIA、EIA或乳胶凝集试验检测半乳甘露聚糖以用于诊断，应用单克隆抗体和夹心ELISA可提高检测敏感性。Platelia Aspergillus EIA（Bio－Rad）已被欧洲癌症研究和治疗组织／侵袭性真菌感染协作组（EORTC／MSG）列入侵袭性曲霉感染的诊断标准，该试剂盒使用小鼠EBA－2单克隆抗体检测GM。研究显示GM试验适用于恶性血液肿瘤患者，但不适用于实体器官移植受体。该抗原水平降低与患者预后良好相关，而抗原水平不变或升高则与治疗失败相关。抗真菌药物的使用会降低GM试验的敏感性。由于GM是水溶性的，也可以在尿、脑脊液、胸腔积液和肺泡灌洗液中检出。使用哌拉西林－三唑巴坦和阿莫西林可能会导致假阳性。有报道发现EBA－2与青霉、链格孢及拟青霉有交叉反应。Busca A报道对异基因干细胞移植病人常规检测曲霉菌半乳甘露聚糖抗原（AGA），若发热超过3d、抗菌治疗无效则再做胸部CT扫描，两者结合可提高侵袭性肺曲霉的诊断效率，早期提示进行抗真菌治疗，可延长病人的生存期。Marr KA等用曲霉菌的半乳甘露聚糖酶免疫分析检测了76个病人的986份血清标本，结果表明以0．5为阳性临界值可提高检测的敏感性和特异性。因GM血症常为一过性，故应对高危人群行动态检测。多项研究推荐使用连续两次OD指数超过0．5作为判定折点 ．以提高反应特异性和阳性预测值。

表7－3 G试验和GM试验的诊断意义

5．新生隐球菌循环荚膜抗原测定　已成为诊断新生隐球菌病，尤其是新生隐球菌脑膜炎的重要手段。乳胶凝集试验（latex agglutination test，LA）法5min即可出结果，特异性达90%～100%，可检出35ng／μl的抗原。ELISA敏感性高于LA，可检出6 ng／μl的抗原。而脑脊液涂片印度墨汁染色镜检和真菌培养阳性率分别为50%和70%。需要注意的是，在检测脑脊液标本时，可能会因为抗原量过高而出现假阴性，此时应做倍比稀释。另外，类风湿因子（rheumatoid factor，RF）与隐球菌抗原可能存在交叉反应，低滴度时难以解释。与毛孢子菌有交叉反应，可采用EDTA或蛋白酶处理或煮沸5min，以除去RF。

二、检测循环抗体

真菌抗体的免疫学检测方法，如补体结合试验（complement fixation test，CF）、免疫扩散试验（immune diffusion test，ID）、乳胶凝集实验（LA）、放射免疫试验（RIA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等，用于常见条件性侵袭性真菌感染早期诊断价值不大，难以达到较高的敏感性和特异性。但真菌抗体检测对某些地方性条件性真菌感染显示出一定的应用价值。利用从真菌提取的天然抗原，成功建立了多种地方性真菌病血清学检测方法，用于包括芽生菌病、球孢子菌病、副球孢子菌病、组织胞浆菌病和毒霉病的早期诊断及流行病学调查，并显示出较高的敏感性和特异性。诊断不能建立在单个高滴度的血清学标本上，应连续进行动态观察。取样应有2～3周的间隔，以便对比。4倍以上增高被认为是有意义的。组织胞浆菌病、球孢子菌病检测特异抗体意义较大，孢子丝菌病在培养阴性而又高度怀疑时也可应用。抗体检测有其局限性，如免疫抑制病人有可能检测不到抗体，导致假阴性。另外，有些阳性结果不能确切反映体内感染情况。如循环中发现念珠菌沉淀素（precipitin），可能只是反映该菌在宿主体内寄居。

三、体外抗原试验

当培养真菌没有产生显著的形态特征时，鉴定菌种常遇到困难。有人采用免疫扩散技术发展了一种体外抗原试验（exoantigen test）检测真菌培养基中的非细胞抗原，适用于以下菌种的鉴定：荚膜组织胞浆菌、皮炎芽生菌、波氏假性阿利什霉、甄氏外瓶霉、粗球孢子菌等。对于一些双相型真菌，沙氏培养基斜面培养10d，用硫柳汞水溶液提取可溶性抗原，然后与特异性抗血清进行免疫扩散。体外抗原试验技术上难度不大，只是对抗血清的特异性及敏感性有较高的要求，目前国外已有一些商业性试剂盒供应。

四、真菌代谢物的检测

真菌代谢物的检测主要包括D－阿拉伯醇（D－arabinitol）、L－阿拉伯醇（L－arabinitol）、甘露聚醇（mannitol）。以酶荧光法定量检测D－阿拉伯醇脱氢酶，可快速诊断侵袭性念珠菌病。在其他系统性真菌感染中该产物也同样增高，提示可以作为诊断手段之一。Jegorov A等报道应用质谱分析，可根据特异真菌代谢产物快速鉴定40多个不同真菌菌株。

五、皮肤试验

迟发性皮肤超敏反应不仅可以判断真菌感染的情况，而且对评价机体的细胞免疫状态有重要意义。因此，对结果的判定应结合临床及其他实验室检查综合分析。因为不同菌之间可能存在交叉抗原，所以多采用几种菌进行皮试对鉴别诊断是适当的。另外，皮试不应在检测循环抗体之前进行，以免引起抗体假阳性出现或滴度假阳性增高。适用于本法的真菌感染包括：组织胞浆菌病、球孢子菌病、副球孢子菌病、孢子丝菌病等。皮肤试验用于对一些系统真菌感染的大规模人群筛选，是一个可靠的流行病学工具。

最后，需要注意的是对于血清学检查结果应多方面综合分析。如机体的免疫状况、基础疾病、用药情况、是否为正常菌丛、选用的血清学方法等，必要时要动态观察。