其他酶标记免疫技术

三、其他酶标记免疫技术

（一）均相酶免疫测定

均相酶免疫测定的特点是不需要对反应系统中结合与游离的酶标记物进行分离。其原理是酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，酶的活性会发生改变。通过测定总酶活性的改变，而推算待测抗原或抗体的含量。均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定，但由于干扰因素较多、灵敏度较非均相法低等原因，临床应用不多。

（二）非均相液相酶免疫测定

非均相液相酶免疫测定又分为平衡法和非平衡法。前者是将待测抗原、酶标记抗原及特异性抗体同时加入，后者是待测抗原、特异性抗体反应一段时间后再加入酶标记抗原。待反应达平衡后，加分离剂，离心分离结合与游离的酶标记物，沉淀物中酶活性与待测抗原成反比。

（三）固相膜免疫测定

固相膜免疫测定是以微孔滤膜作为固相载体的免疫测定技术。常用的固相膜为硝酸纤维素膜（NC膜）。

1.斑点酶联免疫吸附技术（Dot-ELISA）　Dot-ELISA的原理与常规ELISA类似。将少量已知抗原滴加于NC膜上，干燥后经过封闭液处理备用。检测时，滴加待检血清和酶标抗抗体（间接法），洗涤后加入底物显色。阳性反应在膜上出现肉眼可见的着色斑点（图6-12）。

Dot-ELISA的优点是：①特异性强；②敏感性高，比常规ELISA高6～8倍；③试剂用量少，比常规ELISA节约5～10倍；④抗原膜保存期长，-20℃可保存半年；⑤检测结果可长期保存；⑥操作简便，不需要酶联检测仪。

Dot-ELISA广泛应用于各种病毒性疾病、寄生虫病的临床诊断与流行病学调查。

图6-12　Dot-ELISA原理示意

2.免疫印迹技术　免疫印迹技术（immunoblotting test，IBT）又称为酶联免疫电转移印斑技术（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），是将凝胶电泳和抗原抗体反应结合的一种技术，同时具有凝胶电泳的高分辨力和抗原抗体反应的高特异性。该技术由三部分组成（图6-13）：

图6-13　免疫印迹技术原理示意

（1）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）　通过电泳分离蛋白质。所分离的蛋白质条带肉眼不可见。

（2）电转移　选用低电压（100 V）和大电流（1～2 A），通电45 min，将在凝胶中已经分离的蛋白质条带转移至NC膜上。此阶段所分离的蛋白质条带仍然肉眼不可见。

（3）酶免疫定位　在NC膜上依次加入特异性抗体、酶标二抗，再加入底物显色，阳性区带出现。常用的HRP底物为3，3’-二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。

本法广泛应用于抗原组分及其免疫活性的分析，临床上艾滋病病毒感染的检测以此法作为确诊试验。

（四）生物素-亲和素标记技术

1.生物素-亲和素系统（BAS）生物素（biotin，B）又称维生素H，存在于多种动植物中，以蛋黄中含量较高。活化的生物素可与多种蛋白质（如抗体、酶等）、荧光素、胶体金、多糖等结合。亲和素（avidin，A）又称抗生物素蛋白，是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。亲和素由4个亚基组成，每个亚基可结合1个生物素分子，一个亲和素分子可结合4个生物素分子。另外，临床上较为常用的还有一种从链霉菌中提取的亲和素，称为链霉亲和素（streptavidin，SA）。

知识与技能拓展

生物素-亲和素系统的特点

BAS的优越性主要表现在以下几个方面。①灵敏度高：生物素易与蛋白质等生物大分子结合，形成生物素衍生物。每个亲和素分子有四个生物素结合点，可同时结合四个生物素化的衍生物，使BAS具有多级放大作用。②特异性强：亲和素与生物素间的结合具有高度专一性。③稳定性好：亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，呈不可逆反应性；而且酸、碱、蛋白溶解酶等均不影响其结合。④适用性广：生物素和亲和素均可制成多种衍生物，不仅可与各类标记技术结合，用于检测抗原-抗体、激素-受体和核酸系统以及其他多种生物学反应体系，而且也可制成亲和介质，用于分离提纯上述各反应体系中的反应物。

2.生物素-亲和素标记技术在ELISA中的应用

生物素-亲和素标记技术在ELISA中的应用有多种形式，主要有标记生物素-亲和素技术在ELISA中的应用（BA-ELISA）、桥联亲和素-标记生物素技术在ELISA中的应用（BAB-ELISA）以及生物素-亲和素过氧化物酶复合物技术在ELISA中的应用（ABC-ELISA）。

思考题

总结临床上常用的酶免疫技术类型。

（伍华颖）