免疫比浊技术

三、免疫比浊技术

经典的沉淀技术操作繁琐、敏感度低、时间长、难以自动化。根据抗原与抗体能在液体内快速结合的原理，20世纪70年代出现了微量免疫沉淀测定法，即免疫浊度测定技术。它是将液相内的沉淀技术与现代光学仪器和自动分析技术相结合的一项分析技术。当可溶性抗原与相应的抗体特异结合，在二者比例合适、并有一定浓度的电解质存在时，可以形成不溶性的免疫复合物，使反应液出现浊度。这种浊度可用肉眼观察或仪器检测到，可通过浊度推算出复合物的量，即待测抗原或抗体的量。免疫浊度技术可以测量微量的待测物质，并可在抗原抗体反应的第一阶段测得免疫复合物形成的速率，是目前定量测定微量抗原物质并广泛使用的一种高灵敏度、快速的自动化免疫分析技术。

免疫比浊技术按测量方式可分为透射免疫比浊法和散射免疫比浊法；按测定速度可分为速率比浊法和终点比浊法。

（一）透射比浊技术

1.基本原理　抗原和抗体的特异性结合形成复合物使溶液浊度增大，当光线通过时，一部分光被免疫复合物粒子吸收，一部分被散射，还有一部分光透过复合物。在一定范围内，透射光被吸收的量与免疫复合物的量呈正相关。当抗体量恒定时，根据所测得的吸光度值即可计算出待测抗原的量。

2.技术要点　此法要求抗原抗体反应形成的IC达到一定的数量，而且分子颗粒较大（35～100 nm）时才能精确测定，因此需时较长，敏感度相对较低，速度较慢。为了提高复合物形成速度，加入促聚剂，如4％聚乙二醇（MW6000～8000），可使复合物3～10 min形成。

3.影响因素　一是抗原或抗体量大大过剩时易出现可溶性复合物，造成测定误差。二是要保持反应管中抗体蛋白量始终过剩，使仪器的测定范围在低于生理范围到高于正常范围之间；三是结果受血脂的影响，尤其是低稀释度时，脂蛋白的小颗粒可形成浊度，使测定值假性升高。

4.临床应用　本法较单向琼脂扩散技术和火箭电泳等一般免疫化学定量方法敏感、快速、简便。临床上广泛应用于免疫功能、肾脏功能、营养状态等的检查，肾脏疾病、心血管疾病、风湿性疾病、凝血及出血性疾病的检查。

（二）散射比浊技术

在透射比浊技术中，于光源光路的一定角度测量散射光的强度时，光电池上的电信号和散射光强度则呈成正比，经微电脑转换成被测抗原含量的方法为散射比浊技术。常用的有以下两种方法。

1.终点散射比浊技术　抗原和抗体相遇，免疫沉淀反应立即开始，但反应达到平衡通常需10～30 min。免疫浊度测定应在复合物聚合产生絮状沉淀之前进行，否则光散射值降低，影响测定结果。因此，终点散射比浊通常是在免疫反应进行到一定时间时测量其浊度，故也可称为定时散射比浊。

2.速率散射比浊技术　速率散射比浊技术是一种先进的动力学测定技术，1977年由Sternberg首先用于免疫学测定。所谓速率是指单位时间内抗原与抗体反应的速度。抗原与抗体结合形成免疫复合物的速度，在每个单位时间内是不相同的，在抗体过量的情况下，随着反应时间的延长，免疫复合物的总量逐渐增加，通常在25s时出现一个反应最快的速率峰，峰值与抗原量呈正相关。

（三）免疫胶乳比浊技术

1.基本原理　免疫胶乳比浊技术的基本原理与透射比浊技术相似。将抗体吸附到大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，当遇到相应抗原时，胶乳颗粒可以发生凝集。单个胶乳颗粒的大小（直径）在入射光波长之内，光线可透过。当两个以上胶乳颗粒凝聚时，则使透过光减少，吸光度（A值）与胶乳凝聚程度成正比，并与待测抗原量直接相关。

2.技术要点　适用于免疫胶乳浊度测定法的胶乳，其大小（直径）应稍小于入射光的波长，目前多用直径为200 nm的胶乳颗粒。

3.影响因素　首先是选择合适的胶乳，用500 nm波长者，选择100 nm颗粒；用585 nm波长者，则选用100～200 nm颗粒。其次，为了保证抗原抗体的活性，一般用物理吸附法。

4.临床应用　由于数个胶乳发生凝集即能引起透光度的改变，因此可大大提高浊度技术的灵敏度，检出限可达μg/L或ng/L水平。其应用参见透射比浊技术。

思考题

1.分析决定抗原抗体最佳配比的方法。

2.运用双向琼脂扩散技术分析抗原性质。

（张其霞）