免疫组化技术

免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）是免疫学与组织化学相结合的一个分支学科。随着适用于石蜡切片的抗体种类与数目的不断扩大，检测系统不断推陈出新，染色方法不断完善，IHC已成为病理诊断中的常规方法。

（一）基本原理

IHC技术是利用免疫学原理，即抗原抗体具有高特异性、高亲和力的特性，以特异性抗体（一抗）与组织中相应抗原反应后，加入酶标记的第二抗体，二抗与抗原-抗体复合物中的一抗结合，形成抗原-抗体-酶复合物，再借助组织化学的方法，用所标记酶的底物与酶反应生成有色产物，产物生成部位即是抗原存在部位。IHC能在显微镜下确定细胞成分，达到定位准确、定性可靠、定量可能的目的。

（二）IHC检测标本的前期处理

1.组织切片的制备　淋巴造血系统疾病的检测标本主要是淋巴结、脾脏、骨髓组织及少量非造血组织。淋巴结取材厚度不超过2mm，如有淤血、坏死成分应尽量除去;脾脏应尽量去除积血，多点取材，大小以2.0cm×2.0cm×0.2cm为宜;骨髓组织长度应＞1cm。组织取材后立即用10%中性福尔马林固定，以保持组织细胞内抗原物质的活性。骨髓组织含有骨质，制片前需要脱钙，酸性脱钙液对抗原活性有影响，应掌握好脱钙液浓度和脱钙时间（见前述有关内容）。

不同抗原稳定性不同，对固定剂的耐受性有差异，固定时间最好不超过24h，固定时间越长，抗原破坏越明显。如果骨髓组织较小，应相应缩短制片时间。取材及时、固定充分、脱水良好的优质切片是做好免疫组化的基础。

2.细胞涂片的制备　包括外周血、骨髓、胸水、腹水等的细胞涂片。用干净的载玻片推片，涂片应厚薄适中，细胞分布均匀。待涂片稍干后用甲醇:丙酮（1∶1v/v）固定90s后染色，不能在室温下久存。暂不用者，可固定后置干燥器内4℃保存，最好不超过1个月。

（三）IHC方法及操作步骤

IHC技术得以广泛应用，与抗体和检测系统的不断增加、不断更新、不断完善是分不开的。一抗从兔源性多抗、鼠源性单抗至兔源性单抗，产品覆盖面越来越广;检测系统也从直接法、间接法、桥联法、亲和酶标法发展到目前最常用的二步法，其敏感性、特异性都不断提高。

1.链霉菌抗生物素过氧化物酶连接法（SP法）

SP法是在传统的抗生物素-生物素复合物（ABC法）基础上，用链霉菌抗生物素代替ABC法中的卵白素而开发出的新的亲和酶标检测系统，其原理是根据抗生物素有多个与生物素高亲和力的结合位点，既可与辣根过氧化物酶（HRP）结合，也可与生物素结合的特性。当抗原抗体反应后，加入生物素化二抗，再加入HRP标记的链霉菌抗生物素与生物素化二抗结合，然后加入酶的底物，生成有色产物。链霉菌抗生物素是从培养基中提取的纯蛋白质，分子中不含寡糖基、且链霉菌抗生物素-HRP复合物体积又较ABC复合物小，故具有染色背景较低、穿透能力大的特点，敏感性高于ABC法。

操作步骤:

（1）常规石蜡切片脱蜡。

（2）组织切片抗原修复（具体方法见五）。

（3）修复后的组织切片在室温中冷却，磷酸-磷酸钠缓冲液（PBS　pH7.2　0.01mol/L）洗3min×3次。

（4）3%过氧化氢（H2O2）室温孵育10～20min，PBS洗3次。

（5）加二抗同种动物非免疫血清封闭20min，甩掉血清。

（6）加一抗室温湿盒中孵育2h或4℃过夜，PBS洗3次。

（7）加生物素化二抗室温湿盒孵育0.5h，PBS洗3次。

（8）加链霉菌抗生物素-HRP复合物室温湿盒孵育0.5h，PBS洗3次。

（9）加底物3、3-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）显色，显微镜下控制，有阳性表达（黄褐色）后自来水洗终止反应。

（10）harris苏木素淡染细胞核。

（11）脱水、透明、中性树胶封片。

2.二步法　二步法是20世纪90年代末国外开发出来的非生物素检测系统，其原理是用一种可以连接二抗分子和酶分子的物质作为载体，将多个二抗分子和酶螯合成多聚物，代替传统方法中的二抗、三抗。此法克服了旧的检测系统耗时、某些抗体检出率低、内源性生物素干扰的缺陷，使检测系统具更高的敏感性和特异性，是目前最常用的检测系统。可作为载体的物质有高分子葡聚糖、右旋糖酐、氨基酸、有机小分子等，不同公司的产品所采用的载体可能不同，如美国Zymed公司PV9000检测系统，载体为有机小分子，它利用有机小分子将小鼠或兔的免疫球蛋白与HRP连接成多聚体形式，使每一抗体分子与多个酶分子相连，直接放大抗原抗体结合信号;而DaKo公司的Envision检测系统，则采用高分子葡聚糖为载体，将大量的二抗分子和酶聚合在葡聚糖大分子骨架上形成多聚体，具有很强的信号放大作用。

操作步骤:

（1）石蜡切片脱蜡至水。

（2）组织切片抗原修复。

（3）修复后的组织切片在室温冷却，PBS洗3min×3次。

（4)加3%H2O2室温湿盒孵育10～20min，PBS洗3次。

（5)加一抗室温湿盒孵育2h或4℃过夜，PBS洗3次。

（6)加二抗-酶复合物，室温湿盒孵育0.5hPBS洗3次。

（7)加DAB显色，显微镜下控制，有阳性表达时（黄褐色）自来水洗终止反应。

（8)harris苏木素淡染细胞核。

（9)脱水、透明、中性树胶封片。

（四）细胞涂片的IHC染色

许多造血细胞胞质中含丰富的内源性过氧化酶，涂片中不易将其灭活，用标记HRP的检测系统显色后涂片背景深，非特异着色易导致误诊，故常用标记碱性磷酸酶（AP）的检测系统代替，坚固红为酶的底物显色，阳性表达呈深红色。IHC染色方法与上述石蜡切片方法基本相同，只是无需抗原修复，加底物显色后mayer苏木素淡染核，直接用水溶性的明胶甘油封片。

（五）甲醛固定石蜡包埋组织抗原修复方法

1.微波修复

（1）组织切片脱蜡至水，蒸馏水洗3次。

（2）将切片置于盛有抗原修复液（pH6.0、0.01mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或pH9.0、0.01mol/L Tris-EDTA缓冲液）的容器中，微波加热至95～98℃，保持10～15min。

（3）切片连同容器内缓冲液一起冷却至室温（不可取出切片）。

（4）PBS洗3次后进入染色程序。

2.高压修复

(1)组织切片脱蜡至水，蒸馏水洗3次。

(2)将高压锅内放适量修复缓冲液（同微波修复），加热至沸腾。

(3)切片置于架上，放入高压锅中（缓冲液必须覆盖组织），加锅盖，加压力阀。

(4）当高压锅压力阀喷汽时开始计时2min，将压力锅端离火源。

(5）冷却至室温后取出切片，PBS洗3次后进入染色程序。

（六）结果判定

IHC染色前，病理医师需对HE切片有初步诊断意见及鉴别诊断思路，并掌握病变区域细胞形态特点，在此基础上，有的放矢地选择抗体和判定结果。

1.阳性定位　抗原阳性表达在细胞膜、细胞质或细胞核的部位必须明确，不在特定部位表达应视为阴性或非特异性反应。

2.阳性强度及阳性率　阳性强度由细胞所含抗原量和分化程度不同来决定，表现为着色深浅不一，DAB显色强阳性为棕褐色、弱阳性为淡黄色（须排除非特异性着色）;坚固红显色强阳性深红色、弱阳性淡红色（须排除非特异性着色）。细胞涂片则可选择阳性明确、阳性细胞分布均匀的部位，计数200个有核细胞总数中阳性细胞个数作为阳性率，一般白血病分型以阳性细胞占有核细胞≥30%为阳性。而骨髓转移瘤则不需计数阳性率，例如骨髓转移性癌，只要有明确的CK阳性细胞就可确定为转移癌。

3.阳性细胞分布　阳性细胞分布方式可为散在、灶性、弥漫性。阳性细胞的分布特征常作为某些类型淋巴瘤分型的重要依据，对淋巴瘤侵犯骨髓的诊断具有重要的参考价值。

4.阳性细胞形态特征　不同分化阶段的造血细胞形态有所不同，某些类型淋巴瘤的形态学具有特征性，应结合阳性细胞的形态特点正确地分析判断。

综上所述，IHC技术成败的关键因素包括:①固定及时，制作良好的细胞、组织片;②有效的抗原修复技术;③兼顾纯度、稳定性、敏感性、特异性的抗体;④与一抗种属匹配的高敏感性检测系统;⑤全面、正确的结果判定。

（七）试剂配制

市售IHC试剂盒及配套产品配备齐全，抗体、检测系统、显色剂、复染液、封片剂、洗涤缓冲液均有产品出售，各种抗原修复液也有小包装产品，可不用自配。

（八）IHC技术的应用

IHC染色主要用于淋巴造血系统恶性肿瘤的诊断、鉴别诊断和免疫分型。尤其对淋巴瘤的诊断和分型有独到之处。淋巴造血系统肿瘤种类繁多，本文仅涉及临床上最常见的白血病、淋巴瘤类型，急、慢性髓系白血病或骨髓增殖性肿瘤由于免疫表型分化阶段性不如淋系的明显，所以髓系肿瘤的诊断与分型主要根据血象骨髓象和遗传学检查鉴别。为了方便读者查找和做免疫组化选择抗体时参考。将各种血液肿瘤与相应常用推荐抗体及备选抗体介绍于附录A、B、C、D供参考。